赵宗哲， 鲁明明， 赵文明* ， 吴 超* ， 赵 颖， 郝艳娜

(1. 辽宁医学院 药学院，辽宁 锦州121001;2. 大连富生天然药物开发有限公司，辽宁 大连116000)

人参皂苷Rg3 是从人参中提取出来的一种四环三萜类皂苷，对抑制肿瘤生长、转移和浸润，提高机体免疫力作用显著［1］。人参皂苷Rg3 属于BCS 二类药物，水中的溶解度极低，但口服吸收迅速，因此体外溶出速度是其口服吸收的限速步骤［2］。文献报道人参皂苷Rg3 口服后血浆浓度很低，3.2 mg/kg 口服后的Cmax值仅为(16 ±6)ng/mL［3］。无机多孔材料的发展为提高难溶性药物水溶性提供了一个新思路，其解决药物的难溶的原理是利用介孔孔道的高比表面积吸附难溶性药物进入介孔结构，后者强大的空间效应可抑制难溶性药物的结晶度，使难溶性药物以无定形或者微晶态分布在多孔材料的多孔网络中，从而降低了药物粒子的大小，增加了药物的比表面积［4-5］。根据Ostwald-Freundlich 方程与Noyes-Whitney 方程，粒子大小的下降和比表面积的增加不仅能够增加药物的溶出速度，而且能促进纳米级药物粒子与生物膜的接触，有利于药物的吸收［6-8］。为了解决人参皂苷Rg3 的难溶问题，本实验制备了人参皂苷Rg3-介孔二氧化硅纳米粒(Rg3-MSN)固体分散体，旨在提高人参皂苷Rg3 的溶出速率，提高其口服生物利用度。

1 仪器与试剂

人参皂苷Rg3 (大连富生制药有限公司，批号20120803，纯度＞95%);十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、正辛烷、L-赖氨酸、正硅酸乙酯(TEOS)(天津市光复精细化工研究所);苯乙烯(天津市瑞金特化学品有限公司);偶氮二异丁基脒盐酸盐(AIBA，青岛柯信新材料科技有限公司);甲醇、乙腈(天津市科密欧化学试剂有限公司，HPLC 级);十二烷基硫酸钠(国药集团化学试剂有限公司)。

电子天平(AL204，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司);真空干燥箱(DZF6050，上海博远实业有限公司);水浴振荡器(HZS-H，哈尔滨市东明医疗仪器厂);高效液相色谱仪(D-2000，广州菲罗门科学仪器有限公司);红外光谱仪(IRAffinity-1，岛津国际贸易(上海)有限公司);差示扫描量热仪(DSC-60，日本岛津公司);智能溶出试验仪(2RS-8，天津大学无线电厂);X 射线衍射仪(2500 PC，Rigaku Corporation);比表面积及孔径分析仪(SA3100，Beckman Coulter)。

2 方法与结果

2.1 介孔二氧化硅纳米粒的制备 0.1 g 的十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB)置于三颈瓶中，加30 mL水，60 ℃水浴，搅拌溶解形成透明溶液，加入16 mL 的正辛烷，在搅拌下加入苯乙烯 (50 mg/mL)，22 mg 赖氨酸，1 mL TEOS 和AIBA(0.84 mg/mL)，体系呈乳白色，氮气氛围下，60 ℃水浴3 h，过滤得到沉淀，50 ℃干燥得到实心颗粒，550 ℃煅烧去除模板，得到介孔二氧化硅纳米粒［9］。由透射电镜照片(图1)可见纳米粒呈现规则的球状，直径约为100 nm，内部孔道呈放射状，孔道均匀一致，孔径约为10 nm (表1)。

图1 介孔二氧化硅纳米粒(MSN)透射电镜照片Fig.1 TEM pictures of MSN

表1 MSN 和Rg3-MSN 固体分散体的结构参数(±s，n=3)Tab.1 Textural properties of MSN and Rg3-MSN solid dispersion (±s，n=3)

表1 MSN 和Rg3-MSN 固体分散体的结构参数(±s，n=3)Tab.1 Textural properties of MSN and Rg3-MSN solid dispersion (±s，n=3)

注:与MSN 相比，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

样品 比表面积/(m2·g -1)孔容/(cm3·g -1) 孔径/nm MSN 533.43 ±23.34 1.29 ±0.28 9.93 ±1.62 Rg3-MSN 153.98 ±18.68＊＊ 0.62 ±0.10＊＊ 5.30 ±0.87*

2.2 人参皂苷Rg3-介孔二氧化硅纳米粒( Rg3-MSN) 固体分散体的制备 采用溶剂挥发法制备，按1 ∶1、1 ∶2、1 ∶3 (m/m)的比例称分别称取人参皂苷Rg3 和MSN，加混合溶剂三氯甲烷-甲醇-水(6.5 ∶3.5 ∶1)适量，使药物溶解，在搅拌下自然挥干，然后将其置于真空干燥箱中25 ℃干燥12 h 后，得到Rg3-MSN 不同比例的固体分散体。

2.3 Rg3-MSN 固体分散体的表征

2.3.1 氮气吸附与脱附(BET)分析［10-11］用比表面积及孔径分析仪测定人参皂苷Rg3 和Rg3-MSN (1 ∶3)的氮气吸附和脱吸附曲线，测定之前，样品在40 ℃的烘箱中干燥12 h。测定结果如图2 所示，与MSN 相比，Rg3-MSN 的N2吸附分支向低压移动。用BET 法测算样品的比表面积，tplot 法计算微孔体积，BJH 法计算孔径。实验数据采用SPSS 17.0 进行统计分析，检验水准P ＜0.05为差异具有统计学意义。结果如表1 所示，载药之后，介孔二氧化硅纳米粒的比表面积，孔径，孔容积都明显降低，说明人参皂苷Rg3 被吸附进入介孔二氧化硅纳米粒的介孔孔道之中。

图2 MSN 和Rg3-MSN 固体分散体的N2 吸附和脱吸附曲线Fig.2 N2 absorption-desorption isotherms of MSN and Rg3-MSN solid dispersion

2.3.2 差示扫描量热(DSC)分析［4］采用差示扫描量热仪，分别测定人参皂苷Rg3 原料药、MSN、人参皂苷Rg3 和MSN 物理混合物以及Rg3-MSN (1 ∶3)固体分散体的DSC 曲线，加药量5 ～10 mg，氮气体积流量40 mL/min，扫描速度10℃/min，扫描范围20 ～400 ℃。见图3。

图3 MSN、人参皂苷Rg3、人参皂苷Rg3 和MSN 的物理混合物及Rg3-MSN 固体分散体DSC 曲线Fig.3 DSC thermograms for MSN，geinsenoside Rg3，geinsenoside Rg3 and MSN physical mixture and Rg3-MSN solid dispersion

如图3 所示，319 ℃附近出现的吸热峰为人参皂苷Rg3 的熔融峰，此峰在人参皂苷Rg3 和MSN的物理混合物中仍然存在，但是人参皂苷Rg3 以1 ∶3 的比例载入MSN 后，其吸热峰消失，说明人参皂苷Rg3 是以非结晶的状态存在于MSN 中，这是因为MSN 的纳米孔道很小(氮气吸附与脱附分析表明MSN 的孔道直径约为10 nm)，限制了人参皂苷Rg3 结晶的形成。

2.3.3 X 射线衍射(XRD)［12-13］通过X 射线衍射仪分别测定人参皂苷Rg3 原料药、MSN、人参皂苷Rg3 和MSN 物理混合物以及Rg3-MSN (1 ∶3)固体分散体的X 射线衍射曲线，扫描角度(2θ)5 ～60°，扫描速度0.5°/min，步长0.02°。实验结果如图4 所示，人参皂苷Rg3 在5.32°、14.72°、17.96°处有特征衍射峰，在人参皂苷Rg3 和MSN的物理混合物中，其特征衍射峰依然存在，但在Rg3-MSN (1 ∶3)的衍射曲线中人参皂苷Rg3 的特征衍射峰消失，说明药物被全部吸附进入MSN 的介孔孔道中，并以非结晶的状态存在，没有附着在载体表面的结晶药物。

图4 MSN、人参皂苷Rg3、人参皂苷Rg3 和MSN 的物理混合物及Rg3-MSN 固体分散体的X 射线衍射图Fig.4 XRD patterns for MSN，ginsenoside Rg3，ginsenoside Rg3 and MSN physical mixture and Rg3-MSN solid dispersion

2.3.4 红外光谱(FT-IR)测定 通过红外光谱仪测定载体与药物之间的相互作用，以KBr 为背景，扫描波数范围从4 000 ～400 cm-1，结果如图5所示，与MSN 和人参皂苷Rg3 的红外光谱图相比，Rg3-MSN (1 ∶3)固体分散体的红外光谱图无新峰出现，说明介孔二氧化硅纳米粒和人参皂苷Rg3未发生相互反应，二者之间的吸附属于物理吸附。

图5 MSN、人参皂苷Rg3 及Rg3-MSN 固体分散体的傅利叶红外光谱图Fig.5 FT-IR spectra of MSN，ginsenoside Rg3 and Rg3-MSN solid dispersion

2.4 人参皂苷Rg3 测定

2.4.1 色谱条件 Welth C18色谱柱(4.6 mm ×200 mm，5 μm);流动相为乙腈-水(45 ∶55);体积流量1 mL/min;检测波长203 nm，柱温25 ℃，进样量20 μL。人参皂苷Rg3 在15.2 min 出峰，如图6 所示。

图6 人参皂苷Rg3 高效液相色谱图Fig.6 HPLC chrmatograms of ginsenoside Rg3

2.4.2 标准曲线 精密称取干燥至恒定质量的人参皂苷Rg3 对照品5 mg 于10 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，得到500 μg/mL 的贮备液，分别精密量取贮备液0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1 mL 于10 mL 量瓶，0.5%的SDS 溶液稀释定容至刻度。摇匀，取20 μL 进液相检测。以峰面积(A)对质量浓度(X)作回归直线，得回归方程A=8 060X-2 791.7，r =0.999 7，结果表明在1 ～50 μg/mL 质量浓度范围内，线性关系良好。

2.4.3 回收率的测定 称取适量的MSN 于0.5%的SDS 溶液中，按照Rg3-MSN (1 ∶3)的比例，精密加入不同量的人参皂苷Rg3 贮备液，配制成低、中、高(5、25、50 μg/mL)3 个质量浓度的样品，HPLC 法测定人参皂苷Rg3，计算人参皂苷Rg3 的回收率为(99.54 ±0.75)%。

2.4.4 精密度的测定 配制人参皂苷Rg3 低、中、高(5、25、50 μg/mL)3 个质量浓度的样品，分别一天内测定5 次，测得RSD 分别为0.3%、0.4%、0.6%。

2.5 溶解度测定 取人参皂苷Rg3 和Rg3-MSN(1 ∶3)固体分散体分别于装有5 mL 蒸馏水的试管内，使之呈过饱和状态，25 ℃恒温摇床振摇24 h，取液，过0.22 μm 微孔滤膜，HPLC 测定，平行测定3 次，计算人参皂苷Rg3 在水中的平衡溶解度。结果人参皂苷Rg3 原料药的溶解度为(0.84 ±0.16)μg/mL，Rg3-MSN 固体分散体溶解度为(6.35 ±0.45)μg/mL。表明经固体分散后人参皂苷Rg3 的溶解度有显著提高。

2.6 体外溶出度的测定

2.6.1 溶出介质的选择 人参皂苷Rg3 在水中的溶解度极低，一般的溶出介质难以达到漏槽条件，因此需要加入一定量的表面活性剂。在含0.5%的SDS 水溶液中，人参皂苷Rg3 的溶解度约为(278.03 ±12.25)μg/mL，可以满足漏槽条件，因此选择0.5%的SDS 水溶液作为溶出介质。

2.6.2 体外溶出度的测定 按《中国药典》2010年版二部释放度测定第三法，分别称取人参皂苷Rg3 原料药及Rg3-MSN 不同比例的固体分散体(相当于人参皂苷Rg3 10mg)，置小杯中，释放介质为含0.5%的SDS 水溶液，介质体积为250 mL，转速(100 ± 1)r/min，温度(37 ±0. 5)℃。自样品粉末接触溶出介质开始计时，分别于5、10、15、20、30、45、60 min 取样3 mL，过0.22 μm 微孔滤膜，补充同体积新鲜介质［6］，HPLC 测定人参皂苷Rg3 质量浓度，计算累积溶出度(见图7)。结果表明不同比例固体分散体的溶出速率均比人参皂苷Rg3 原料药明显提高，人参皂苷Rg3原料药1 h 时累积溶出度不到20%，Rg3-MSN(1 ∶3)固体分散体1 h 的累积溶出可达82.08%，随着人参皂苷Rg3 和MSN 比例的减小，溶出变慢，原因是当人参皂苷Rg3 和MSN 的比例较小时，人参皂苷Rg3 不能完全进入MSN 的介孔孔道中，一部分人参皂苷Rg3 随着溶剂的挥发，附着在MSN的表面，这一部分药物的依然以结晶的状态存在，因此导致溶出速率的降低。

图7 人参皂苷Rg3 和不同比例的Rg3-MSN 固体分散体的溶出曲线(±s，n=3)Fig.7 Dissolution profile of ginsenoside Rg3 and Rg3-MSN solid dispersion in different ratios (±s，n=3)

3 讨论

3.1 人参皂苷Rg3 在水及多种有机溶剂中的溶解度均比较差，只在混合溶剂［三氯甲烷-甲醇-水(6.5 ∶3.5 ∶1)］ 中有较好的溶解度，能达到20 mg/mL，因此选择混合溶剂来溶解人参皂苷Rg3，制备Rg3-MSN 固体分散体。

3.2 本实验所制备的介孔二氧化硅纳米粒，能够在一定程度上改善人参皂苷Rg3 的溶解度和体外溶出速率。介孔二氧化硅纳米粒的介孔孔道的空间限制效应能够有效的抑制药物的结晶度，降低药物粒子的大小，从而改善难溶性药物的水溶性。因此，介孔二氧化硅纳米粒在改善难溶性药物水溶性方面是一种有潜力的载体材料，为纳米技术改善难溶性药物水溶性研究提供科学的实验依据。

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