封小龙 刘红芝 刘 丽 王 强

冷沉法制备花生球蛋白及伴花生球蛋白工艺研究

封小龙 刘红芝 刘 丽 王 强

（农业部农产品加工与质量控制重点开放实验室中国农业科学院农产品加工研究所，北京 100193）

以花生球蛋白提取率为指标，对冷沉法提取花生球蛋白及伴花生球蛋白进行工艺优化。在单因素的基础上，经2次提取，通过L9（43）正交试验设计确定最佳提取工艺，结果表明，影响花生球蛋白提取率的各因素显著程度：冷沉时间＞料液比＞磷酸缓冲溶液浓度＞溶液pH。最佳提取条件为：料液比5∶10、溶液pH 7.1、磷酸缓冲溶液浓度0.4 mol／L、冷沉时间4 h。在此条件下花生球蛋白的提取率为53.60%。花生球蛋白提取后的上清，即为伴花生球蛋白。研究发现，不同冷沉次数对花生球蛋白组分纯度影响不显著，直接干燥上清比上清酸沉后制备的伴花生球蛋白蛋白含量要低，但是组分纯度无显著差异。真空冷冻干燥制备的花生球蛋白组分纯度76.40%，伴花生球蛋白组分纯度64.10%；喷雾干燥制备的花生球蛋白组分纯度74.30%，伴花生球蛋白组分纯度62.73%，不同干燥方式对花生蛋白组分纯度影响显著（P＜0.01）。

花生粉 冷沉法 花生球蛋白 伴花生球蛋白

花生是全球最重要的四大油料作物之一，是食用和榨油兼用的油料作物，中国是世界上重要的花生生产大国，产量约占世界总产量的40%［1］。脱脂花生粕是油脂压榨后的副产物，其蛋白含量达50%，是我国重要的植物蛋白资源［2］。花生蛋白分为两大类：90%为盐溶性蛋白，10%为水溶性蛋白［3］。盐溶性蛋白主要包括花生球蛋白（14S），伴花生球蛋白Ⅰ（2S）和伴花生球蛋白Ⅱ（7.8S），它们之间的含量比例分别为花生球蛋白73%，伴花生球蛋白Ⅰ6%，伴花生球蛋白Ⅱ21%［4］。花生球蛋白和伴花生球蛋白是花生中含量最多且最重要的两种组分，它们的性质影响花生蛋白的各项功能特性［5］。

目前，花生球蛋白和伴花生球蛋白的提取方法主要是硫酸铵沉淀法［6］。硫酸铵沉淀法分离提取花生组分是基于蛋白质盐析特性，可以将花生球蛋白、伴花生球蛋白Ⅰ、伴花生球蛋白Ⅱ3种组分分开，由于条件限制，硫酸铵沉淀法仅适用于小规模提取的实验室研究，不适合产业化生产。冷沉法是利用花生球蛋白具有低温冷沉这一特性对花生蛋白组分进行分离，Neucere［7］曾对冷沉法提取花生蛋白组分进行过相关报道，但是提取工艺与硫酸铵沉淀法相结合，并没有单独对冷沉法提取花生球蛋白和伴球蛋白进行系统研究。Basha等［8］通过Sephacryl S-300柱层析分离纯化冷沉蛋白，探讨冷沉时间、离子强度、溶液pH等不同因素对其影响，并分离制备冷沉蛋白Ⅰ和冷沉蛋白Ⅱ。本试验采用冷沉法对花生球蛋白和伴花生球蛋白进行分离制备，考察了料液比、溶液pH、磷酸缓冲溶液浓度、冷沉时间等因素对花生球蛋白提取率的影响，并对影响花生球蛋白和伴花生球蛋白组分纯度的因素进行探讨，冷沉法分离制备花生蛋白组分工艺的确立，旨在为真正实现两种组分产业化制备提供理论和方法指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

花生脱脂粉：山东省高唐蓝山集团；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

CRZZGⅡ高速冷冻离心机：日本Hitachi公司；KJELTEC 2300自动凯氏定氮仪：丹麦FOSS公司；B-290小型喷雾干燥机：瑞士BUCHI公司；LGJ-25真空冷冻干燥机：北京四环科学仪器公司；垂直板电泳槽（仪）：北京百晶生物技术有限公司；90-4数显控温磁力搅拌器：上海振荣科学仪器有限公司；凝胶成像系统：AlphaEase FC美国；YP3001 N电子天平：上海精密科学仪器有限公司；Casarte冰箱：海尔公司。

1.3 试验方法

1.3.1 蛋白含量测定

脱脂花生粉和溶液中蛋白质含量测定采用GB 5009.5—2003凯氏定氮法测定［9］。

1.3.2 十二烷基硫酸钠电泳（SDS-PAGE）

根据郭尧君［10］报道 SDS-PAGE电泳方法，略有调整。浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度为13%，电泳进样前，将2.0 mg样品与0.5 mL样品缓冲液震荡混匀，煮沸5 min，迅速冷却，并离心5 min，电泳上样量为4.0μL。凝胶电泳于恒压下进行，在浓缩胶中电压为80 V，进入分离胶后增至110 V。等电泳前沿跑至距玻璃板边缘1 cm左右时停止电泳。将凝胶胶片取出放入适量考马斯亮蓝R250染色1 h，再用甲醇和醋酸混合液脱色，期间换脱色液2～3次，至蛋白质谱带清晰时为止。

1.3.3 花生球蛋白、伴花生球蛋白组分纯度测定方法

用凝胶成像软件AlphaEase FC扫描电泳胶片，对花生蛋白的组分纯度进行分析。各组分纯度由该组分对应条带算得的光密度总和除以全部条带光密度的总和确定。通过染色带的强弱分析，可以得到某一特定蛋白占总蛋白含量的相对比值，即样品的组分纯度。

1.4 试验设计

1.4.1 花生球蛋白和伴花生球蛋白制备工艺

1.4.1.1 试验的工艺流程

将花生脱脂粉用一定pH和浓度的磷酸缓冲溶液混合溶解，搅拌1 h，离心（常温，8 000 r／min，30 min）。去除沉淀，取上清于2℃冷沉一定时间，然后离心（2℃，8 000 r／min，30 min）。沉淀经干燥（冷冻干燥或喷雾干燥）得花生球蛋白，上清干燥（冷冻干燥或喷雾干燥）得伴花生球蛋白。工艺流程如图1所示：

图1 冷沉法分离花生球蛋白和伴花生球蛋白流程图

1.4.1.2 花生球蛋白提取率计算

以花生球蛋白提取率为指标，提取率越大，花生球蛋白提出越多，从而伴花生球蛋白蛋白纯度越高。称取一定质量的脱脂花生粉m0，在提取工艺中，对磷酸缓冲溶液第1次提取的蛋白上清称重m1，并测定液体中蛋白含量，计算上清中蛋白（总蛋白）含量；对第2次冷沉离心后的上清称重m2，并测定液体中蛋

式中：48.99%为脱脂花生粉蛋白质量分数。

1.4.2 冷沉条件优化

1.4.2.1 单因素试验设计

在确定浸提次数的基础上，本试验重点考察提取步骤中可能影响花生球蛋白提取率的料液比、磷酸缓冲溶液浓度、溶液pH以及冷沉时间4个因素，设置水平分别为料液比：1∶10、2∶10、3∶10、4∶10、5∶10；溶液 pH：6.0、6.5、7.0、7.5、8.0；磷酸缓冲溶液浓度0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol／L；冷沉时间：0、2、4、8、12、16、20 h。

1.4.2.2 正交试验设计

在单因素的基础上，采用DPS软件进行L9（43）正交试验设计（表1）。对试验结果进行极差分析，进而确定球蛋白最佳提取工艺。白含量，计算冷沉上清中蛋白（伴花生球蛋白）含量，低温离心后所得的沉淀即为花生球蛋白。因此：

表1 正交试验设计表

1.4.3 花生蛋白组分纯度摸索

1.4.3.1 不同冷沉次数制备花生球蛋白

通过最佳工艺制备花生球蛋白，然后用磷酸缓冲溶液继续溶解沉淀，并在2℃继续冷沉。用磷酸缓冲溶液反复浸提、冷沉花生球蛋白，制备1、2、3、4、5次冷沉冻干样品。通过进行SDS-PAGE电泳，分析花生球蛋白亚基条带的变化，研究冷沉次数对其组分纯度的影响。

1.4.3.2 不同方式制备伴花生球蛋白

通过最优工艺提取花生球蛋白，对冷沉上清采取2种处理方式制备伴花生球蛋白：直接干燥—上清直接进行真空冷冻干燥，制备伴花生球蛋白样品；酸沉后干燥—调节上清pH至4.5，并离心（4 500 r／min，20 min），去除上清，然后真空冷冻干燥沉淀制备伴花生球蛋白样品，比较2种方式制备的伴花生球蛋白的蛋白含量及组分纯度。

1.4.3.3 不同干燥方式制备花生球蛋白和伴花生球蛋白

通过最优工艺提取花生球蛋白，采用酸沉后干燥的方式制备伴花生球蛋白。用真空冷冻干燥和喷雾干燥2种方式制备花生球蛋白及伴花生球蛋白样品，对其进行SDS-PAGE电泳分析，经光密度扫描测定花生球蛋白和伴花生球蛋白的组分纯度，并测定其蛋白含量。

1.4.4 数据分析

数据处理是采用MSExcel 2010和DPS软件，所有试验均重复3次。

2 结果与分析

2.1 冷沉法提取花生球蛋白单因素试验

2.1.1 料液比对花生球蛋白提取率的影响

在溶液pH 7.5、磷酸缓冲溶液浓度0.2 mol／L、冷沉时间16 h的条件下，考察料液比对花生球蛋白提取率的影响，结果如图2所示。随着料液比的增加，花生球蛋白的提取率呈先升高后降低的趋势，在料液比为4∶10时提取率达到最大。可能是因为磷酸缓冲溶液提取的上清在低温下放置，料液比较大和较小时均不利于花生球蛋白冷沉，从而使花生球蛋白得率偏低。

图2 料液比对花生球蛋白提取率的影响

2.1.2 溶液pH对花生球蛋白提取率的影响

图3 溶液pH对花生球蛋白提取率的影响

在料液比4∶10、磷酸缓冲溶液浓度 0.2 mol／L、冷沉时间16 h的条件下，考察溶液pH对花生球蛋白提取率的影响，结果如图3所示。随着pH的增大，蛋白溶出增多，花生球蛋白的提取率逐渐增大，pH 7.5时花生球蛋白的提取率达到35%，pH再增加会对蛋白质的功能性质产生影响［11-12］。因此选择在溶液pH 7.5的条件下对花生球蛋白进行提取。

2.1.3 磷酸缓冲溶液浓度对花生球蛋白提取率的影响

在料液比4∶10、溶液pH 7.5、冷沉时间16 h的条件下，考察磷酸缓冲溶液浓度对花生球蛋白提取率的影响，结果如图4所示。在0.1～0.3 mol／L时，随着磷酸缓冲溶液浓度的增大，花生球蛋白的提取率呈上升趋势，从12%上升至40%，表明磷酸缓冲溶液在一定范围内有利于花生球蛋白的提取，但是在0.3 mol／L以后，花生球蛋白的提取率变化趋于平稳。因此，选取磷酸缓冲溶液浓度为0.3 mol／L。

图4 磷酸缓冲溶液浓度对花生球蛋白提取率的影响

2.1.4 冷沉时间对花生球蛋白提取率的影响

在料液比4∶10、溶液pH 7.5、磷酸缓冲溶液浓度0.2 mol／L的条件下，考察冷沉时间对花生球蛋白提取率的影响，结果如图5所示。在0～4 h范围内，随着冷沉时间的延长，花生球蛋白的提取率急剧上升。冷沉4 h以后，花生球蛋白提取率趋于平稳，冷沉时间的增加对花生球蛋白提取率影响甚微，可能是花生球蛋白冷沉达到动态平衡。因此，选择冷沉时间为4 h。

图5 冷沉时间对花生球蛋白提取率的影响

2.2 花生脱脂粉浸提次数的确定

以花生蛋白总蛋白提取率为指标确定最佳浸提次数。在料液比为4∶10，磷酸缓冲溶液浓度为0.2 mol／L，溶液 pH为7.5的条件下，浸提次数取1、2、3、4、5次。浸提次数对总蛋白提取率如图6所示。试验结果表明，花生蛋白的提取率在1次提取至2次提取时迅速增加，增加幅度为16.70%，而超过2次后则增速大幅度放缓，趋于平稳。这主要是由于每次浸提时，花生蛋白溶出率达到动态平衡，两次浸提后，花生蛋白基本已溶出，并且过多的浸提次数会增加磷酸缓冲溶液的用量，加大成本，不利于工业化生产，故选取浸提次数为2次。因此在确定浸提次数为两次的基础上，进行正交试验。

图6 浸提次数对花生总蛋白提取率的影响

2.3 花生球蛋白冷沉条件优化

2.3.1 磷酸缓冲溶液提取花生球蛋白正交优化试验

根据单因素试验结果，确定出最优参数为料液比4∶10、溶液 pH 7.5、磷酸缓冲溶液浓度0.3 mol／L、冷沉时间4 h。

表2 正交试验极差分析表

通过2次浸提花生脱脂粉，对花生球蛋白进行提取。在单因素的基础上，进行L9（43）四因素三水平正交试验设计，结果用Duncan新复极差法分析，对各因素的影响进行显著性分析，正交试验结果和极差分析如表2所示。各因素的极差越大说明其对花生球蛋白的提取率影响越显著，各因素对花生球蛋白提取率影响的主次顺序依次为：D（冷沉时间）＞A（料液比）＞C（磷酸缓冲溶液浓度）＞B（溶液pH）。最优组合为 A3B3C3D2，即料液比为5∶10、溶液pH为7.9、磷酸缓冲溶液浓度为0.4 mol／L、冷沉时间为4 h。

2.3.2 磷酸缓冲溶液提取花生球蛋白试验优化及验证

A3B1C3D2为正交试验9组中提取率最高的一组浸提工艺条件，提取率达到54.71%。以A3B1C3D2和A3B3C3D22组工艺条件做1次验证试验，验证结果如表3所示。根据正交试验极差分析和试验验证结果，确定花生球蛋白最佳提取工艺参数为A3B1C3D2：即料液比为5∶10、溶液pH为7.1、磷酸缓冲溶液浓度为0.4 mol／L、冷沉时间为4 h。以该最优浸提工艺，提取花生球蛋白，离心后上清干燥即为伴花生球蛋白。

表3 模型验证试验

2.4 花生蛋白组分纯度摸索

2.4.1 磷酸缓冲溶液冷沉次数对花生球蛋白组分纯度的影响

花生蛋白主要由花生贮藏蛋白组成［13-14］（表4），包括花生球蛋白（40.5、37.5、35.5、23.5 ku）；伴花生球蛋白Ⅱ（61.0 ku）和伴花生球蛋白Ⅰ（15.5、17.0、18.0 ku）。

通过不同冷沉次数，采用真空冷冻干燥的方式制备花生球蛋白样品，并进行SDS-PAGE电泳（图7），经光密度分析，测定不同浸提次数所得的花生球蛋白组分纯度如表5所示。表明1次冷沉花生球蛋白的组分纯度为77.97%，而5次冷沉后组分纯度仅升高2.03%，为80.00%。虽然不同冷沉次数制备的花生球蛋白样品组分纯度有略微的升高，但是幅度均很小。经DPS显著性分析，发现不同冷沉次数制备的花生球蛋白组分纯度并无显著性差异。

表4 花生蛋白质组成

图7 不同冷沉次数制备花生球蛋白SDS-PAGE图谱

表5 不同冷沉次数制备花生球蛋白组分纯度

2.4.2 不同方式制备伴花生球蛋白

图8 不同方式制备伴花生球蛋白SDS-PAGE图谱

真空冷冻干燥制备的伴花生球蛋白样品，经SDS-PAGE电泳（图8），通过光密度扫描分析测定其组分纯度，见表6。数据表明，通过上清直接冻干制备的伴花生球蛋白组分纯度64.6%，蛋白质量分数28.88%；而酸沉后冻干制备的伴花生球蛋白的组分纯度64.1%，蛋白质量分数84.52%。

经DPS显著性分析，发现不同方式制备的伴花生球蛋白的组分纯度并无显著性差异；上清直接冻干制备的伴花生球蛋白蛋白含量较高，主要是因为直接冻干制备的伴花生球蛋白中多糖、纤维等杂质较多。综合两方面的因素考虑，选择酸沉后干燥的方式制备伴花生球蛋白。

表6 不同方式制备伴花生球蛋白组分纯度和蛋白含量

2.4.3 不同干燥方式制备花生球蛋白和伴花生球蛋白

在最优工艺条件下提取花生球蛋白，上清通过酸沉后干燥的方式制备伴花生球蛋白，采用真空冷冻干燥和喷雾干燥2种干燥方式制备花生球蛋白和伴花生球蛋白样品，SDS-PAGE电泳图谱如图9所示，组分纯度如表7所示。

图9 不同干燥方式制备花生蛋白组分SDS-PAGE图谱

表7 不同干燥方式制备花生蛋白组分纯度

真空冷冻干燥和喷雾干燥制备的花生球蛋白组分纯度分别为76.40%、74.30%，喷干比冻干制备的花生球蛋白组分纯度低2%；真空冷冻干燥和喷雾干燥制备的伴花生球蛋白组分纯度分别为64.10%、62.73%，喷干比冻干制备的伴花生球蛋白组分纯度低1.37%。经DPS显著性分析，发现不同干燥方式制备的花生蛋白组分纯度有显著性差异。Chiou［15］曾报道，加热会对花生球蛋白和伴花生球蛋白产生很大影响，使蛋白亚基发生变化。

据文献报道硫酸铵沉淀法分离花生蛋白组分，花生球蛋白组分纯度为85.53%，伴花生球蛋白组分纯度为75.81%［13］。冷沉法制备的花生蛋白组分纯度较低，可能是因为硫酸铵沉淀法分离制备的花生蛋白组分主要利用的是花生蛋白组分盐析的特性，分离纯度较高，而冷沉法是利用的花生球蛋白低温沉淀的特性，杂质相对较多。

3 结论

3.1 以花生球蛋白的提取率为指标，通过单因素和L9（43）四因素三水平正交试验分析，在浸提次数为2次的基础上，确立冷沉法分离制备花生蛋白组分的最佳工艺条件：即料液比为5∶10、溶液pH为7.1、磷酸缓冲溶液浓度为0.4 mol／L、冷沉时间为4 h，在此条件下花生球蛋白的提取率为53.60%。各因素对花生球蛋白提取率的影响顺序为：冷沉时间＞料液比＞磷酸缓冲溶液浓度＞溶液pH。

3.2 花生球蛋白组分纯度随冷沉次数的增加略有升高，1次冷沉花生球蛋白的组分纯度为77.97%，而5次冷沉时，花生球蛋白组分纯度只升高2.03%，为80.00%，冷沉次数对花生球蛋白组分纯度影响并不显著。

3.3 不同方式制备伴花生球蛋白—直接干燥和酸沉后干燥，对伴花生球蛋白的组分纯度影响不显著；但是直接冻干上清制备的伴花生球蛋白蛋白含量仅为28.88%，而酸沉后制备的伴花生球蛋白，蛋白质量分数远远高于直接冻干的样品。因此确定对上清酸沉后干燥的方式制备伴花生球蛋白，得到的伴花生球蛋白组分纯度为64.1%，蛋白质量分数为84.52%。

3.4 分别采用真空冷冻干燥和喷雾干燥2种方式制备花生球蛋白和伴花生球蛋白。冷冻干燥和喷雾干燥制备的花生球蛋白组分纯度分别为76.40%、74.30%，制备的伴花生球蛋白组分纯度分别为64.10%、62.73%。喷雾干燥制备的样品组分纯度均比冷冻干燥制备的样品组分纯度低，且差异显著（P＜0.01）。

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Cryoprecipitation Extraction Technology of Arachin and Conarachin

Feng Xiaolong Liu Hongzhi Liu Li Wang Qiang
（Key Laboratory of Agro-Products Processing，Ministry of Agriculture Institute of Agro-Products Processing Science and Technology，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193）

The study has taken the extraction ratio of arachin as an index to have a technology for extracting arachin and conarachin by cryoprecipitation research.On the basis of single factor experiments，after twice extraction，the extraction conditions have been optimized by orthogonal experimental design of L9（43）.The results showed that cryo-time and the rate of solution to solid were the main factors which effected to the arachin extraction rate，and followed by the buffer concentration as well as the pH value.The optimum extraction conditions were as follows：the rate of solution to solid 5：10（m／V），pH value 7.1，buffer concentration 0.4 mol／L，cryo-time 4 h.On the condition，the arachin extraction rate was 53.60%.After the extraction of arachin，the supernatant was conarachin.The result showed that the difference of times of cryoprecipitation has no effect on the purity of arachin.The content of protein of drying supernatant directly is lower than that of acid-depositing，but the method of extracting conarachin does not effect to the purity.The purity of arachin and conarachin is 76.40%and 64.10%respectively prepared by vacuum drying；74.30%and 62.73%prepared by spray drying.Different types of drying exert significant effect on the purity of peanut proteins（P＜0.01）.

peanut flour，cryoprecipitation，arachin，conarachin

TS201.2

A

1003-0174（2014）03-0057-07

2009公益性行业科研专项（200903043），“十二五”国家科技支撑计划（2012BAD29B00）

2013-04-09

封小龙，男，1986年出生，硕士，粮油加工与功能食品

王强，男，1965年出生，研究员，博士生导师，粮油加工与功能食品