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(青岛大学医学院附属医院肾内科，山东 青岛 266003)

研究表明，肾脏缺血再灌注损伤(IRI)与氧化应激反应密切相关，而肾脏IRI的可逆性可能与生物体内的抗氧化机制有关，血红素加氧酶-1(HO-1)是生物体内一种重要的抗氧化蛋白[1]，氧化应激反应时能够显著表达。维生素C(VitC)和促红细胞生成素(EPO)是两种抗氧化剂[2]，两种药物联合应用是否能够增强HO-1的表达，减轻肾脏病理损伤，国内外尚未有该方面的研究报道。本研究拟通过建立大鼠肾脏IRI模型，观察两种抗氧化剂对肾脏IRI保护作用及其可能的机制，从而为临床肾脏IRI的防治提供理论依据和防治策略。

1 材料和方法

1.1 材料来源

健康雄性Wistar大鼠50只，8周龄，体质量200～300 g(青岛市药检所动物实验中心提供)。适应性喂养1周后，随机分为假手术组(A组)、缺血再灌注组(B组)、VitC预处理组(C组)、EPO预处理组(D组)、VitC并EPO预处理组(E组)共5组，每组10只大鼠。

1.2 仪器与和试剂

重组人EPO、VitC(上海信谊药厂有限公司),兔抗鼠HO-1抗体、Envision二步法免疫组化检测试剂盒及二氨基联苯胺(DAB)显色液(北京中山生物技术有限公司),丙二醛(MDA)、HO-1 ELISA试剂盒(青岛沃尔森生物技术有限公司)。

1.3 动物模型的建立及各组的处理

A组只打开腹腔，游离双侧肾蒂但不夹闭。B组大鼠在实验前禁食12 h、饮水不限，建立肾脏IR模型[3]。C组和D组分别在夹闭肾蒂前2 h腹腔注射VitC(2 mmol/kg)和EPO(5 000 U/kg)。E组给予维生素C和EPO，其用药方法分别与C、D组相同。

1.4 标本收集及检测方法

各组大鼠于肾脏IR后24 h，麻醉后摘眼球取血，并尽快留取肾组织。于收集标本24 h内检测各组血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)水平；采用HO-1、MDA的ELISA试剂盒分别检测血清HO-1、MDA的水平；苏木精-伊红(HE)染色光的镜下观察肾组织的形态学变化；按照JABLONSKI等[4]方法，依据近端肾小管损伤的程度分为5级，每组选取50个视野，计数各个等级所在视野的个数，即记为各个等级的分数，计分越高，表示肾小管损伤越严重。采用HPIAS-1000彩色图像分析仪测定肾组织HO-1的表达，测定选定目标区域的阳性密度(选定区域的阳性面积/选定区域)及阳性点的平均吸光度值，两者的乘积即为各选定区域的阳性表达总量，取其平均值为每例标本的阳性表达量。

1.5 统计学方法

2 结 果

2.1 各组大鼠肾功能变化

与A组大鼠比较，B、C、D、E组血清BUN、Scr水平均明显升高(F=414.63、387.89,q=9.58～6 388.47，P<0.05)，E组大鼠血清BUN、Scr水平与B、C、D组比较，差异有显著意义(q=18.33～5 572.02，P<0.05)。见表1。

2.2 各组血清HO-1、MDA水平比较

与A组相比，B、C、D、E组血清中HO-1、MDA水平均有明显升高(F=315.73、38.97，q=16.83～55.52，P<0.05)；C、D、E组血清中HO-1水平均较B组明显升高(q=51.39～169.43，P<0.05)，而MDA均较B组明显下降(q=5.59～10.62，P<0.05)；与C、D组比较，E组HO-1水平显著升高(q=118.03、119.17，P<0.05)，而MDA水平明显下降(q=5.03、3.74，P<0.05)。见表1。

2.3 各组肾组织形态学变化及肾小管损伤评分

光镜下A组肾小球和肾小管结构基本完整。与A组相比，B组弥漫大片状肾小管上皮细胞崩解，细胞碎屑堵塞管腔但肾小球结构基本正常，C、D组见到小灶状肾小管上皮细胞坏死，E组仅见部分肾小管上皮细胞轻度水肿。B、C、D、E组肾小管损伤评分与A组相比，差异有显著意义(Hc=129.77，q=10.26～15.37,P<0.05)；C、D组肾小管损伤评分与E组相比，差异有显著意义(q=12.07、16.91,P<0.05)；C组肾小管损伤评分与D组相比，差异无显著性(P>0.05)。见表2。

表1 各组大鼠血清BUN、Scr、HO-1、MDA水平比较

表2 各组大鼠肾小管损伤程度计分比较(视野)

2.4 各组肾组织HO-1的表达与定量分析

肉眼观察A组肾组织HO-1只有微量表达；B组与A组相比，HO-1表达稍增加，且胞浆局灶着色轻；C、D、E组呈弥漫性染色、且染色较重，其中E组最显著。A、B、C、D、E组HO-1的表达水平分别为(7.01±0.50)%、(27.33±1.54)%、(56.22±1.55)%、(59.06±1.39)%、(92.99±2.44)%；与A组大鼠比较，其他4组HO-1的表达水平均明显升高(F=2 040.00，q=28.23～119.32,P<0.05)；与B组大鼠比较，C、D、E组HO-1的表达水平均显著升高(q=40.14～91.08,P<0.05)，其中E组升高最显著，C、D两组HO-1的表达比较差异无显著性(P>0.05)。

3 讨 论

肾脏IRI是指多种原因导致血液中断或不足使肾脏缺血，恢复血流灌注时肾脏功能障碍和结构破坏反而加重的现象[5]，临床上肾移植、部分肾切除术等均会引起肾脏IRI。IR阶段氧自由基大量释放，引起组织损伤。MDA是一种过氧化终末产物，其水平可反映肾组织脂质过氧化的程度[6]。本研究结果显示，B组血清中MDA的水平明显升高,提示氧化应激增强可能是导致肾脏IRI的重要原因之一。

肾脏IR时大量氧自由基的释放造成组织损伤，同时也启动了机体的内在抗氧化机制，其中HO-1是一种重要的抗氧化蛋白[7]，它作为一种重要的诱导型蛋白，在生理状况下，HO-1在部分肾小管上皮细胞中有少量表达，当IRI时能够大量表达，与本研究结果一致。HO-1是催化血红素的起始酶和限速酶，HO-1本身及其催化血红素的代谢产物可以通过多层次、多方面的作用机制减轻氧化应激带来的损伤[8]。GUELER等[9]研究显示，在肾脏缺血前给予HO-1阻断剂锡原卟啉，单核巨噬细胞中HO-1的表达减少，肾组织损伤严重。另有研究显示，诱导型HO-1表达具有一定的时效性，在夹闭大鼠双侧肾动脉30 min后再灌注24 h时HO-1表达达到高峰，超过24 h后HO-1表达开始下降[10]，因此，在肾脏IR早期诱导HO-1的表达对保护肾脏功能至关重要。

VitC和EPO是两种重要的抗氧化剂，探索其能否诱导HO-1高表达有重要的临床意义。本研究结果显示，与B组相比，VitC组能够增强肾组织HO-1的表达，降低血中MDA的水平，肾脏病理损伤减轻。VitC对于肾脏IRI的保护机制较复杂，GENC等[11]认为氧化应激能够使转录因子Nrf2与细胞骨架蛋白Keap 1解离、活化、转位进入胞核，启动HO-1等抗氧化酶基因的表达，阻止脂质过氧化反应。本研究结果还显示，EPO组也能够增强肾组织HO-1的表达，减轻肾脏病理损伤。关于EPO诱导HO-1表达的确切机制尚不明确，CAL等[12]研究认为，IR时EPO能够与其受体特异性结合，引起蛋白酪氨酸激酶-2(Jak2)发生自体磷酸化，Jak2的激活可以引起包括促分裂原活化蛋白激酶途径的磷酸化，而HO-1的诱导性表达也与促分裂原活化蛋白激酶途径的磷酸化有关，推测EPO可能通过促分裂原活化蛋白激酶途径诱导HO-1的表达。

此外，本研究还进一步探讨了VitC和EPO联合应用对肾脏IRI的作用。结果表明，与单用VitC或EPO相比，E组大鼠肾组织HO-1表达量显著升高，血清MDA水平明显降低，肾脏病理损伤程度明显减轻，提示两者联合预处理对肾脏IRI具有协同保护作用，而其具体作用机制有待进一步研究。

总之，VitC和EPO能通过多种途径诱导肾组织HO-1表达增加，抑制氧化应激，从而在肾脏IRI中发挥保护作用，且两者联合应用时这一作用更为显著，这为临床肾脏IRI的防治提供了更加广阔的思路。

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