，，，，

(青岛大学医学院,山东 青岛 266003 1 附属医院血液科; 2 血液学教研室; 3 附属医院中心实验室)

淋巴瘤是一种异质性疾病，根据组织形态学特征，分为霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，是发病率较高的恶性血液系统肿瘤[1]。随着分子生物学、基因组学的研究进展,部分淋巴瘤的发病机制已明确，靶向治疗的研究及临床新药的应用使其具有治愈的可能。但仍有部分淋巴瘤易复发，难以治愈。研究显示，信号通路可能参与淋巴瘤的发生。Notch信号通路是一种广泛且高度保守的信号通路，该通路参与细胞的增殖、分化和凋亡[2-3]，在造血细胞的增殖和分化中起重要作用，其异常时可导致血液系统恶性肿瘤[4]。本研究检测淋巴瘤Notch1蛋白的表达情况，探讨其在淋巴瘤发生中的作用。

1 资料与方法

1.1 标本及其来源

收集2009年10月—2011年11月我院附属医院病理科确诊的淋巴瘤标本50例，其病历资料完整。男30例，女20例；年龄6～80岁。诊断符合《血液病诊断及疗效标准》[5]。其中T细胞淋巴瘤30例，B细胞淋巴瘤13例，霍奇金淋巴瘤7例。所有病人病理活检前均未进行抗肿瘤化疗或放疗。另取15例淋巴结反应增生组织标本作为对照组。所有组织标本应用40 g/L甲醛固定，石蜡包埋，4 μm连续切片。

1.2 主要试剂

兔抗人跨膜受体蛋白Notch1抗体、SP免疫组化检测试剂盒、DAB染色试剂盒，均购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.3 Notch1蛋白表达检测

采用免疫组织化学SP染色法。石蜡切片60 ℃烘片，常规二甲苯脱蜡、乙醇水化，枸橼酸缓冲液高温抗原修复15 min，体积分数0.03的H2O2室温避光孵育20 min，阻断内源性过氧化物酶。正常山羊血清封闭抗原，滴加一抗(稀释度1∶100)，4 ℃过夜,滴加二抗、三抗。DAB显色，苏木精复染，蓝化、分化，脱水、透明，干燥后中性树胶封片。用已知子宫内膜癌阳性标本作阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。

1.4 结果判定

根据文献[6]方法进行染色程度和染色强度判定。高倍镜下观察，肿瘤细胞染色程度：无细胞染色为阴性，染色细胞占1%～33%为1分，34%～66%为2分，67%～100%为3分。染色强度：不着色为0分，浅棕黄色为1分，棕黄色为2分，深褐色为3分。综合上述两项评分之和判定结果：≤1分为阴性(-)，2分以上为阳性(+)。

1.5 统计学分析

用SPSS 17.0及PPMS 1.5[7]统计软件进行数据处理，数据间比较采用四格表卡方检验或Fisher确切概率法。

2 结 果

2.1 淋巴瘤组和对照组Notch1蛋白表达比较

Notch1蛋白免疫组化阳性染色主要集中在淋巴瘤细胞膜和(或)胞浆，部分淋巴瘤细胞核亦染色，阳性细胞呈散在分布；对照组有1例细胞浆着色。Notch1蛋白在淋巴瘤组和对照组中的阳性率分别为58.00%(29/50)、6.67%(1/15)，两者比较差异有统计学意义(χ2=12.234,P<0.01)。

2.2 不同类型淋巴瘤组织Notch1蛋白表达水平比较

Notch1蛋白在T细胞淋巴瘤组、霍奇金淋巴瘤组及B细胞淋巴瘤组中的阳性率分别为70.00%(21/30)、71.40%(5/7)，23.80%(3/13)，T细胞淋巴瘤组和霍奇金淋巴瘤组Notch1蛋白表达明显高于对照组，差异有显著性(χ2=16.052，P<0.05；P=0.004)；而B细胞淋巴瘤组与对照组Notch1蛋白表达水平差异无显著意义(P=0.311)。3种类型淋巴瘤Notch1蛋白表达相比较，T细胞淋巴瘤组高于B细胞淋巴瘤组，差异有统计学意义(χ2=8.097，P<0.05)；霍奇金淋巴瘤组与T细胞淋巴瘤组比较、霍奇金淋巴瘤组和B细胞淋巴瘤组比较，差异均无统计学意义(P=1.000、0.062)。

2.3 不同年龄、性别淋巴瘤病人Notch1蛋白表达比较

不同年龄、不同性别淋巴瘤病人Notch1蛋白阳性表达比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 不同年龄、性别淋巴瘤病人Notch1蛋白表达比较(例)

3 讨 论

Notch蛋白是高度保守的跨膜蛋白，由Notch受体蛋白、Notch配体蛋白、转录因子CSL(DNA结合蛋白)和靶分子组成。正常情况下，Notch信号介入多种细胞凋亡、增殖和分化等多效性作用，调节多细胞动物的形态发育和形成[2]。Notch1最早在人类T淋巴母细胞白血病中被鉴定出来，提示Notch信号通路与肿瘤相关[8]。Notch1在多数恶性肿瘤中表达上调，但也有少数实验显示其表达下调[9]。其原因可能与细胞特异性有关。本文研究结果显示，淋巴瘤组织中Notch1蛋白表达水平较对照组明显增高。提示Notch1蛋白高表达可能与淋巴瘤的发生有关。

Notch1在淋巴细胞发育的早期阶段促进共同淋系前体细胞向T淋巴细胞发育，共同淋巴细胞祖细胞分化成T淋巴细胞祖细胞后，Notch1信号能促进T淋巴细胞向Tαβ细胞发育，抑制其向Tγδ细胞发育；同时还促进CD4+、CD8+双阳性胸腺细胞向CD4+或CD8+单阳性细胞分化[10]。Notch1信号通路能加快细胞周期，使细胞处于增殖状态，抑制细胞分化和凋亡[11]。Notch1信号在T细胞发育过程中任意环节的紊乱都可能与细胞恶性转化相关。本文研究结果显示，T细胞淋巴瘤组中Notch1蛋白的表达明显高于对照组，与JUNDT等[12]研究结果相似。国外有研究显示，大多数肠型T细胞淋巴瘤存在Notch1基因的点突变[13]；也有研究证实，超过50%的T淋巴母细胞淋巴瘤在Notch1的HD和PEST区域存在突变[14]。表明T细胞淋巴瘤的发生可能与Notch1蛋白的表达升高有关，Notch1蛋白的高表达可能与其基因突变有关。

本文的研究结果还显示，霍奇金淋巴瘤组织中Notch1蛋白80%高表达，提示 Notch1可能在霍奇金淋巴瘤中发挥一定的作用。这与JUNDT等[12]的研究结果类似，表明霍奇金淋巴瘤的发生与Notch1的表达升高有关。Notch信号通路可通过促进细胞生长和抑制细胞凋亡诱导霍奇金淋巴瘤的发生。

Notch受体在B细胞淋巴瘤中的作用存在分歧。TOHDA等[15]研究结果表明，弥漫大B细胞淋巴瘤细胞株(TMD8)存在靶基因Hes-1的表达，表明Notch信号被活化，提示在某些B细胞淋巴瘤中，Notch活化是致癌基因。另有研究结果显示，活化的 Notch1抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，起抑癌基因的作用[16]。本研究结果显示，B细胞淋巴瘤组织中Notch1蛋白表达与对照组比较差异无显著性，与上述文献结果不一致，提示Notch1信号通路在淋巴瘤中的作用是多环节的，各个环节所起的作用不同。Notch信号在B细胞淋巴瘤发生中的作用还有待进一步研究。

综上所述，Notch1的异常表达可能与淋巴瘤的形成有关，Notch1在不同类型淋巴瘤中的作用可能不同。本文结果为靶向抑制Notch1信号通路治疗淋巴瘤提供了初步依据。Notch信号在淋巴瘤发生发展中的确切作用及其机制还有待进一步研究。

[1] 史春雷,王玲,黄梅娟,等.18F-FDG PET/CT在结外淋巴瘤诊治中的临床应用[J]. 齐鲁医学杂志, 2010,25(5):394-398.

[2] KARANU F N, MURDOCH B, GALLACHER L, et al. The notch ligand jagged-1 represents a novel growth factor of human hematopoietic stem cells[J]. Journal of Experimental Medicine, 2000,192(9):1365-1372.

[3] DUMORTIER A, WILSON A, MACDONALD H R, et al. Paradigms of notch signaling in mammals[J]. International Journal of Hematology, 2005,82(4):277-284.

[4] CHIARAMONTE R, BASILE A, TASSI E, et al. A wide role for NOTCH1 signaling in acute leukemia[J]. Cancer Letters, 2005, 219(1):113-120.

[5] 张之南,沈悌. 血液病诊断及疗效标准[M]. 3版. 北京:科学出版社, 2007:217-228.

[6] GAO J, LIU J, FAN D, et al. Up-regulated expression of Notch1 and Jagged1 in human colon adenocarcinoma[J]. Pathologie Biologie, 2011,59(6):298-302.

[7] 周晓彬. 医用统计学软件 PPMS 1.5 在医学科学研究中的应用价值[J]. 青岛大学医学院学报, 2011,47(6):504-506.

[8] ELLISEN L W, BIRD J, WEST D C, et al. TAN-1, the human homolog of the Drosophila notch gene, is broken by chromosomal translocations in T lymphoblastic neoplasms[J]. Cell, 1991,66(4):649-661.

[9] 王敏,李锦添,曾益新,等. Notch1,P21WAFl和Involucrin在鼻咽癌组织中的表达及意义[J]. 癌症, 2005,24(10):1230-1234.

[10] DORSCH M, ZHENG GANG, YOWE D, et al. Ectopic expression of Delta4 impairs hematopoietic development and leads to lymphoproliferative disease[J]. Blood, 2002,100(6):2046-2055.

[11] CULLION K, DRAHEIM K M, HERMANCE N, et al. Targeting the notch1 and mTOR pathways in a mouse T-ALL model[J]. Blood, 2009,113(24):6172-6181.

[12] JUNDT F, ANAGNOSTOPOULOS I, FÖRSTER R, et al. Activated notch1 signaling promotes tumor cell proliferation and survival in hodgkin and anaplastic large cell lymphoma[J]. Blood, 2002,99(9):3398-3403.

[14] WENG A P, FERRANDO A A, LEE W, et al. Activating mutations of NOTCH1 in human T cell acute lymphoblastic leukemia[J]. Science, 2004,306(5694):269-271.

[15] TOHDA S, SATO T, KOGOSHI H, et al. Establishment of a novel B-cell lymphoma cell line with suppressed growth by gamma-secretase inhibitors[J]. Leukemia Research, 2006,30(11):1385-1390.

[16] ZWEIDLER-MCKAY P A, HE YIPING, XU LANWEI, et al. Notch signaling is a potent inducer of growth arrest and apoptosis in a wide range of B-cell malignancies[J]. Blood, 2005,106(12):3898-3906.