赵 胡

(阜阳师范学院生命科学学院,阜阳 236041)

分子生物学实验教学能加深学生对课本理论知识的理解和运用，同时也是学生掌握基本技术，提高科学思维能力和独立操作能力的有效途径[1]。植物RNA提取的基本技术广泛应用于科研和生产实践中，掌握这一基本技术是生物学专业学生学习后续分子生物学实验的必备条件，因为学生提取RNA的质量和浓度必需符合后续实验的要求，包括cDNA的反转录、RT-PCR、cDNA文库的构建等相关的实验操作。所以让学生学习并掌握植物RNA提取的原理技术和方法是为以后进一步学习奠定良好的基础。本实验室从2005年起开设了这一实验，使学生对分子生物学技术有了感性认识，提高了学生学习兴趣。

植物RNA提取是一项常规技术，实验原理相对简单，但操作流程复杂。一般认为植物RNA提取对实验室和实验器具要求比较苛刻，如果没有专门的RNA实验室，本科生实验课程在大实验室的有限条件下实验难以获得成功，这样往往大大降低学生对分子生物学实验操作的积极性和热情[2]。尽管不同文献报道关于RNA方法不尽相同和对相关方法的改进，但是实验操作步骤的繁琐和实验要求的严格往往限制了学生课堂实验教学的运用并使学生对开设这一实验产生了畏难心理。为此，我们根据自身多年的教学实践和对各院校采用实验教材的分析，对“植物RNA提取”实验进行了改进并做了总结，以供同行商榷。

1 植物RNA提取方法的选择

目前教科书和文献报道上RNA提取方法主要有4种。第一种方法[3]是异硫氰酸胍—酚法(GTC法)，这一方法的原理主要是异硫氰酸胍与β-巯基乙醇共同作用抑制RNase活性，同时异硫氰酸胍与十二烷基肌酸钠作用共同使蛋白质变性，从而释放RNA，酸性条件下DNA极少发生解离并同蛋白质一起变性被离心下来，RNA则溶于上清液中。第二种方法[4]是SDS—苯酚法，细胞内大部分RNA均与蛋白质结合在一起以核蛋白的形式存在。因此，提取RNA时要把RNA与蛋白质分离并除去，将细胞置于含有十二烷基磺酸钠的缓冲液中，加等体积的水饱和酚，通过剧烈震荡，然后离心形成上层水相和下层的酚相。核酸溶于水相被苯酚变性的蛋白质或溶于水相或在两相界面处形成凝胶层。第三种方法[5]是CTAB法，即十六烷基三甲基溴化铵是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性，在高离子强度溶液中CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸，通过有机溶剂抽提，去除蛋白多糖酚类等杂质后，加入乙醇沉淀即可使核酸分离。第四种方法就是利用takara公司生产的Trizol试剂盒简称Trizol法，Trizol试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂，它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性，加入氯仿后离心样品分成水样层和有机层，RNA存在于水样存中，收集上面的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀还原出来。以上这4种方法在植物总RNA提取中均有运用，但根据不同情况选择相应的方法或调整方法中的成分组分[6]。如多糖含量高时可选择CTAB法，蛋白含量高时可选择SDS法，多酚含量高时可添加β-巯基乙醇等还原剂或增加PVP的含量。在讲解植物RNA提取原理时，我们对这4种方法都逐一介绍，尽管方法不同，但原理都是大同小异的，主要是利用各种烈性试剂破碎细胞、蛋白变性和DNA沉淀，释放RNA并溶解在有机相中而后抽提沉淀RNA。在让学生具体操作实验的过程中，我们仅选择一种方法，即Trizol法抽提植物组织中的总RNA。这主要是考虑到：1)各种RNA抽提试剂尤其是破碎组织样品，抑制RNase的烈性试剂对人体都有一定的毒性和腐蚀性，为了尽量避免因试剂配制带来的实验室环境污染和安全隐患，我们在实验经费许可的条件下直接从公司订购试剂盒提供给学生做实验。2)RNA提取实验的各种试剂繁多，配置起来很繁琐，而且对配制溶液的精确度如pH值都有一定的要求，人为的配制溶液可能因为试剂的交叉污染而达不到理想的实验效果。我们可以把更多的时间和经历用来指导学生的具体的实验操作上。另外，为了保证这一实验的成功，我们对植物材料的选择也做了充分的考虑，尽量选择幼嫩组织如黄化苗，避免次生代谢物含量高的植物组织样品RNA的提取，研磨样品切记贪多，一般0.1～0.2 g足以用来抽提RNA。

2 实验准备和操作过程的简易化改进

一直以来，同行专家都认为植物RNA提取实验对实验室和实验器皿的要求很高，如要有专门的RNA提取实验室，实验所用的枪头、离心管都要用DEPC水浸泡过夜后高温灭菌烘干备用，实验操作应在超净工作台上进行，学生做实验时应带上口罩和一次性的手套并经常更换一次性手套，实验操作过程应少说话等等。然而在一个大实验室里，让几十个学生分组实验同时做植物RNA提取实验，要同时达到以上这些要求的确有一定的难度，这也是这一实验在高校分子生物学实验教学中一直不够理想的主要原因。我们对近几年植物RNA提取实验进行了认真总结和思考并结合文献中RNA提取操作步骤逐一排查操作误区，发现RNA提取的质量与后续实验要求有很大关系，如构建cDNA文库或做芯片杂交对RNA要求的质量和浓度要求很高，如果是仅做基因的表达分析或是目的基因的克隆，那么相对来说RNA质量要求就低一点。因此根据后续实验的目的和要求，我们应灵活运用RNA提取的原则和注意事项。我们为学生开设的这一基础性实验，其目的是让学生掌握RNA提取的实验原理和技术要求，而对后续实验的要求并不高，只要让学生了解RNA提取的严格性和规范化即可，但在具体的实验操作上，在不影响实验结果的情况，结合学生实验的实际情况应有一定的变通。如我们在预实验中仅把枪头盒离心管高温高压灭菌，事先并没有用DEPC水处理过夜，研磨样品的研钵并没有高温灼烧，仅是导入少量的酒精烧2～3 min以除去其中的RNase污染。实验的整个操作过程并没有在超净工作台上进行，与平常其它实验一样在普通的实验台面上进行。但在整个实验操作过程中应尽量避免说话，操作迅速很重要，尤其是在样品研磨这一步骤中一定要在低温液氮下进行，粉末状样品在液氮环境下应尽量迅速转移到含有强烈抑制RNase活性的Trizol试剂中，这样保证样品的RNA始终在RNase无法发挥作用的环境下保持完整性不被降解。实验中间步骤的RNA提取操作都是在有机溶剂的环境下进行，RNase发挥作用的机会很小。在RNA沉淀的步骤中，这一过程尽量在低温下操作，沉淀的清洗步骤动作迅速，避免长时间在空气中吹干，最后将沉淀的RNA用含有DEPC的水溶解。我们按照这一操作要点，在达到预期实验效果的同时大大减轻了实验的准备工作，实验结果电泳如图1所示。在随后的正式实验教学中，学生分组实验提取RNA均取得了很好的实验结果，表明我们对植物RNA提取实验的某些环节的简化是成功的，增强了我们普及这一实验的信心和积极性。

传统方法认为RNA电泳应用甲醛变性的凝胶进行，然而我们用普通的TAE缓冲液在不含甲醛的条件下短时间内(15min)电泳总RNA仍然可以清晰的看到三条带，同时也避免了甲醛的污染。这一结果表明尽管RNA抽提的实验条件要求苛刻，但只要我们操作熟练、注意细节和要点、动作迅速，短时间内RNA是不会很快降解的。我们对这一方法的改进收到了良好的教学效果。

图1 豌豆幼苗总RNA电泳图

1—高标准高要求的实验室环境条件下提取豌豆幼苗的总RNA；2、3—普通实验室条件下简易化操作提取豌豆幼苗的总RNA。

3 实验操作的原则性和灵活性的统一运用

在实验教学中，学生严格按照教科书或指导书上进行实验操作对培养学生严谨的科研作风和科研态度至关重要，然而严格实验操作并不等同于死板教条地按照教科书上的要求去一步一步的完成，那样的实验教学只是机械地传授知识，学生只能被动地接受，学习的热情和积极性受到极大地抑制，达不到应有的教学效果。实验教学的关键是让学生理解实验原理，领会实验操作中注意细节的原因和道理，掌握实验操作中关键的技术环节，反复训练直到学生能熟能生巧。只有这样才能达到我们预期的实验效果。针对为学生开设“植物总RNA提取”这一实验为例，我们应该让学生明确植物总RNA提取对实验条件和实验室环境要求很高，其主要原因就是我们周围环境中大量存在RNase，RNA又易被RNase降解，这样会导致我们实验的失败。但是这样讲授往往会让学生产生畏难心理，担心实验不能成功，做起实验放不开，手忙脚乱，反而会导致实验结果不理想。我们随即把话锋一转，告诉学生任何酶发挥作用都需要一定的环境和一定的时间，如果我们能提供一个提取RNA的无RNase的微环境，并且我们的操作迅速，同样也能提取出一个效果很好的总RNA，这样才能提高学生对做好这一实验的信心，有利于培养学生的兴趣。

[1]张海涛,刘慧明,丁 航,等. 分子生物学教学实验中质粒提取原理与电泳图谱的探讨[J]. 生物学杂志,2008,25(6): 74-75.

[2]刘 明,祁晓廷. “总RNA 提取和鉴定”的实验技巧及方法改进[J]. 生物学通报,2005,40(11): 62.

[3]徐 杰,李明启. 异硫氰酸胍-酚-氯仿—步法提取RNA时某些操作技术的改进[J]. 植物生理学通讯,1996,32(3): 206-208.

[4]刘彦华. 苹果铁高效基因型生物技术的研究—根总RNA提取方法的比较及mRNA的纯化[D].北 京: 中国农业大学,1999.

[5]刘 志,杨永华. CTAB法提取中草药材滇紫草细胞总RNA[J]. 生物技术通讯,2004,15(4): 372-373.

[6]朱丹丹,董 燕,周 联,等. 鱼腥草叶片总RNA 提取方法的比较与分析[J]. 广州中医药大学学报,2012,29(3): 300-304.