杨 帆,李福英,何雄飞,曾润颖,产竹华

(国家海洋局海洋生物遗传资源重点实验室 国家海洋局第三海洋研究所，厦门 361005)

脂肪酶(Lipase,EC 3.1.1.3)也叫三酰甘油脂水解酶，是一类重要的酯键水解酶，能够在油-水界面上催化天然油脂(甘油三脂)生成游离的脂肪酸、甘油和甘油单酯或甘油二酯，广泛存在于动物、植物和微生物中[1-3]。现代工业中脂肪酶经常被应用于油脂水解[4]、食品加工[5]、食品品质改良[6,7]、疾病诊断[8]、催化药物合成[9-11]、皮革生产、可生物降解的无污染洗涤剂的研发[12]和生物柴油的生产等方面[13， 14]。在诸多来源的脂肪酶中，微生物脂肪酶是工业用脂肪酶的重要来源，是生物技术和有机化学应用中使用最为广泛的酶类之一。其原因在于微生物种类多、繁殖快，易发生遗传变异，产生的脂肪酶具有比动植物脂肪酶作用更广的 pH 值、反应温度范围以及底物专一性；而且微生物来源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，适合于工业化大生产和样品提纯[15]。随着工业的发展与人类需求的不断扩大，得到一株高产、性质特殊的产脂肪酶菌株越来越成为脂肪酶应用研究开发的关键。在加紧寻找自然界中的优秀产酶菌株之外，诱变育种也是获得高产菌株的有效手段。

诱变育种是使用物理或化学诱变剂处理菌株，促进其突变率大幅提高，然后采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选少数符合育种目的的突变株，达到提高代谢产物的产量、改进产品质量、扩大品种和简化生产工艺的目的[16-18]。本文从一株深海产低温脂肪酶的菌株Dspro004出发，通过紫外诱变得到了高产菌株，并进行了该突变菌株的遗传稳定性的测试，为该菌株今后的工业生产奠定了良好的实验基础。

1 材料与方法

1.1 菌株

本文实验采用的野生菌株Dspro004分离自东太平洋(107°38′ 23″ W，13°19′ 40″ N)水深4950 m的深海沉积物，采用脂肪酶筛选培养基筛选获得并保存于本实验室。

1.2 培养基

1)LB培养基：Yeast Extract 0.5%，Tryptone 1%，NaCl 1%。

2)脂肪酶筛选培养基：猪油1%，Yeast Extract 0.5%，琼脂1.5%，由原位海水配制。

三丁酸甘油酯筛选培养基：三丁酸甘油酯1%，Yeast Extract 0.5%，琼脂1.5%，由原位海水配制。

1.3 紫外诱变初筛

1.3.1 诱变剂量的确定

将Dspro004菌种接种至液体LB培养基中，绘制生长曲线并确定其对数期。取对数生长期的菌液，经5000 r/min离心5 min，弃去上清液。用灭菌的生理盐水(0.85% NaCl)溶液洗涤菌体两次以除去培养基成分，继续用生理盐水调节菌液OD600至0.6～0.7，取5 mL稀释后的菌液至直径60 mm的无菌培养皿中进行紫外照射诱变。紫外照射条件为：输出功率2×6 W，距离30 cm。紫外灯预热20 min后，放入菌液，在黑暗条件下进行紫外照射，同时进行磁力搅拌。照射不同时间后，立刻取出500 μL菌液在20℃下避光孵育30 min。在红光环境中，用生理盐水进行梯度稀释，取10-4，10-5两个稀释度的菌液各100 μL，均匀涂布LB平板，每个梯度设置3个平行样。按相同方法对未经照射的出发菌株进行孵育和稀释涂布，以作为对照平板。涂布完毕后将平板放置在20℃下避光培养1～4 d，待菌落长出后计数菌落，统计致死率[19]。

1.3.2 诱变筛选

在诱变预实验结果的基础上，选择合适的致死率所对应的诱变时间，进行紫外照射。之后避光孵育30 min，并用灭菌生理盐水进行梯度稀释，取10-5稀释度的菌液100 μL在三丁酸甘油酯筛选平板上进行均匀涂布。置于15℃下避光培养3～5 d，根据透明圈大小筛选突变菌株。

1.4 紫外诱变复筛与遗传稳定性测试

挑选透明圈较大的菌落用液体LB培养基在15℃、200 r/min的条件下振荡培养48 h，取发酵液上清，利用pNPP法测定脂肪酶活力。将复筛平板上的高活力突变菌株与出发菌株一起，进行连续传代培养，每一代进行保种并测定酶活。其中每个菌株均设3个平行样，取平均值作为结果。各代均以出发菌株作为对照，以确定突变菌株的高产能力是否稳定遗传。

1.5 pNPP法测定脂肪酶活力[20]

脂肪酶作用于底物(p-NPP) 后会产生黄色的对硝基酚p-Nitrophenol(p-NP)，该产物在405nm处具有光吸收值。通过该光谱法可以检测培养基中脂肪酶的活力。脂肪酶活单位U定义为：1 min酶解底物释放出1 μmol的p-Nitrophenol所需的酶量为一个酶活单位。

配制终浓度为100 μmol/L的p-Nitrophenyl palnitate溶液，配制时先用5 mL的异丙醇溶解pNPP粉末，再用0.05 mol/L，pH9.0的Tris-HCl定容至100 mL。向2955 μL底物溶液中加入15μL(0.1 μg/μL)脂肪酶液，在25℃下反应10 min后加入30μL的NaOH(5 mol/L)溶液终止反应，测定OD405值。

2 实验结果

2.1 Dspro004野生菌的紫外诱变初筛

通过对野生菌株不同时间的紫外诱变菌液的涂板计数，得到对应诱变时间的致死率结果(图1)。致死率在70%～80%之间时，产生正突变的几率较高，更有利于进一步筛选[21]。涂板计数结果表明：当功率为12W，照射距离为30 cm，照射时间为20 min时，致死率达到81.3%，因此选定20 min为最佳照射时间。稀释度为10-4时可以看清菌落，但是透明圈分辨起来困难，故而稀释度为10-5时效果最佳。

图1 Dspro004菌株紫外诱变效果

将紫外照射后的菌液在三丁酸甘油筛选平板上均匀涂布，20℃下培养3 d出现透明圈。统计菌落数，与出发菌株相比，致死率约为79.1%，符合正向突变有利筛选条件。以出发菌株为对照，挑选出90株透明圈/直径比(HE)值均大于对照的变异菌株，依次编号为UM1～UM90。

2.2 Dspro004高产脂肪酶突变菌株复筛与遗传稳定性

从上述平板中挑选诱变后HE值较大的菌落UM3、UM5、UM14、UM16、UM32、UM49、UM55在液体LB培养基中进行15℃、48 h的摇培，并取发酵液测定脂肪酶活力。结果表明(图2)，相对于出发菌株，菌株UM3活力可达到2560 U/mg，相对出发菌株提高33.9%，活力提高最明显。

选取菌株UM3进行遗传稳定性试验，与出发菌株同时进行了20代传代培养和酶活测定(表1)。各代菌体发酵液的平均酶活力相对出发菌株酶活保持在134%～139%之间，酶活力保持在2540～2710 U/mg，并且同代无显著差异，表明该菌株的产酶具有较好的遗传稳定性。

图2 Dspro004突变菌株复筛结果

表1 UM3突变株的遗传稳定性实验

2.3 菌株UM3脂肪酶酶学性质分析

2.3.1 温度对酶活性的影响

分别测定菌株UM3脂肪酶在不同温度下(5℃～70℃)水解底物的活力，以研究其最适作用温度。结果表明，酶在20℃～30℃范围具有较高的酶活力，酶的最适反应温度为30℃(图3)，表现出明显的冷适应特征，因此该酶可确定为低温脂肪酶，后续实验脂肪酶活力测定均在30℃下进行。

图3 温度对脂肪酶活力的影响

2.3.2 pH值对酶活性的影响

用磷酸氢钠-柠檬酸钠(pH值4～8)、Tris-HCl(pH值7～8)、NaHCO3-Na2CO3(pH值8～10)、Na2HPO4-NaOH(pH值11)缓冲液配制pNPP底物溶液，测定不同pH值下脂肪酶的酶活力。实验表明(图4)，酶在pH值7.5～9.5的范围具有较高的酶活力，酶的最适反应pH值为8.5，表明该酶为碱性脂肪酶。

图4 pH值对脂肪酶活力的影响

2.3.3 酶的热稳定性

将酶液放置不同温度下保温一定时间后取出酶液，测定残余脂肪酶的活力，在最适温度下反应。实验结果表明(图5)，该脂肪酶在20℃～30℃具有良好的热稳定性，20℃保持12 h后仍具有80%以上的活力，30℃下保持12 h后酶活力仍有70%。40℃保温2 h活力剩余72%，4 h仅余6%。50℃以上0.2 h基本丧失酶活。

图5 温度对脂肪酶稳定性的影响

2.3.4 酶液对pH值的耐受性

图6 pH值对脂肪酶稳定性的影响

分别将酶液加入pH值6～9的磷酸盐缓冲液冰浴中保存一定时间后，将酶液在最适反应温度下测定残余酶活力。结果表明，在pH值8条件下保持12 h后残余酶活力仍有80%，在pH值7条件下保持12 h后残余酶活力为75%，在pH值6和pH值9条件下稳定性较差，保持12 h后分别剩余51%和46%(图6)。

3 结论

与传统的诱变育种相比，建立在现代基因操作技术基础上的基因改造更为精确，但诱变育种往往能带来更为复杂的连锁反应结果，且更简便易行、快速、收效大，因而在实际工业应用中被更多地采用。紫外诱变安全简便，对环境毒害作用小，不易回复突变，因此本文采用紫外照射作为诱变剂筛选脂肪酶高产菌株。选择致死率为81%的诱变剂量，获得了酶活力最高达到2710 U/mg的突变株，产酶活力比出发菌株提高了约39%。虽然这与工业生产菌株的4000～6000U/mg[22]还有一定差距，希望通过进一步的发酵条件的优化和代谢的调控来提高脂肪酶产量。

对于生产菌株来说，必须要具备稳定的遗传性状才能在工业生产上广泛应用。本文所筛选到的菌株UM3突变株连续20代继代培养结果表明，该突变株的遗传性状稳定，为未来该菌株的实际工程应用奠定了良好的实验基础。

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