王少峰， 石先阳

(安徽大学资源与环境工程学院，合肥 230601)

苯酚是工业废水中常见的一种水溶性有机污染物。含酚废水的排放会污染水质，造成生物体中蛋白质变性,引起细胞中毒或死亡，破坏水生生态系统，危害人类健康，被许多国家列为优先控制污染物[1]。

含酚废水的处理主要采用物理法、化学法与生物法。其中生物法因高效、经济且无二次污染而被广泛应用。目前，含酚废水的生物处理主要采用好氧生物处理如活性污泥法和厌氧生物处理。但传统的活性污泥法对酚浓度较大的废水处理时间较长，成本高。含酚废水的厌氧处理大多在UASB(upflow anaerobic sludge blanket)反应器中进行[2]。但苯酚对很多微生物的活性特别是产甲烷细菌的活性有强的抑制作用使得UASB启动周期较长，限制了厌氧法处理苯酚的应用[1]。

通过向含酚废水生物处理系统中投加高效苯酚降解菌，可提高系统对苯酚的耐受浓度和去除率，从而缩短处理时间。因此如何选育高效降解苯酚的微生物成为研究的热点之一[3,4]。近年来，多种降解苯酚的微生物得到分离和鉴定，如：根瘤菌(Rhizobia)[5]、酵母菌(YeastTrichosporoncutaneum)[6]、醋酸钙不动杆菌(A.calcoaceticus)[7,8]、热带假丝酵母菌 (Candidatrop-icalisZ-04)[9]、假单胞菌(Pseudonomonassp.)[10]、产酸克雷伯菌(Klebsiellaoxytoca)[11]、红球菌(Rhodococcus)[12]等。但这些筛选出的微生物主要生活在中性，或偏碱的环境中，且对高浓度的含酚废水处理效果不够理想，因而筛选出对苯酚具有更强耐受能力和降解能力的高效菌种，具有广阔的应用前景。

本文以从土壤中筛选出的一株高效苯酚降解菌为研究对象，针对酸性含酚废水的特性，研究了影响苯酚生物降解的关键因子并采用动力学方法对苯酚的生物降解过程进行了分析，可为酸性含酚废水的处理提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 培养基

1.1.1 富集培养基[11]牛肉膏5.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 5.0 g、蒸馏水1000 mL，pH值7.2～7.4。

1.1.2 驯化培养基 KH2PO40.5 g、K2HPO40.5 g、MgSO40.5 g、NH4Cl 1.0 g、NaCl 0.2 g、MnSO40.05 g、FeSO40.05 g、蒸馏水1000 mL,pH值7.2～7.4。

1.1.3 保存培养基 牛肉膏5.0 g、蛋白胨10.0 g、琼脂15～ 20 g、NaCl 5.0 g、蒸馏水1000 mL，pH值7.2～7.4。

1.2 菌种的驯化和分离

采集土壤样品，经充分振荡、浸泡、曝气后，取土壤水溶液5 mL，加入至50 mL苯酚浓度为200 mg/L的无机盐培养基中，37 ℃连续振荡培养48 h后取5%的培养液转移至苯酚浓度为600 mg/L的培养基中，培养72 h后进行转接，依次提高苯酚浓度至800、1000、1200、1400、1600 mg/L。最后将浓度为1600 mg/L的培养液涂平板，30 ℃恒温培养直至长出菌落，挑取单菌落，通过平板划线分离菌株。

1.3 苯酚的降解

将筛选的菌株在富集培养基中培养至生长对数期，(OD值为0.6～0.8)，离心得湿菌体[13]，接种于以苯酚为唯一碳源的驯化培养基中(转速为130 r/min，接种量达到2 g/L)，每隔6 h取样，研究温度、pH、初始浓度对菌株降解苯酚的影响。

1.4 分析方法

苯酚浓度测定采用装备有毛细管柱DB-FFAP(30 mm × 0.25 mm × 0.25 μm)的Agient7890A型气相色谱仪进行；载气为氮气，流速2.8 mL/min；程序升温，初温100 ℃，维持1 min；升温速率20 ℃/min，终温180 ℃，维持1 min；汽化室温度250 ℃，分流进样(10∶1)；FID检测器温度300 ℃；氢流量30 mL/min，空气流量400 mL/min[14]。菌体浓度测定采用光电比浊法和干重法[15]。

1.5 菌株降解苯酚能力的测定

通过定时测定降解实验培养液中残留的苯酚浓度计算苯酚降解率，公式如下:

(1)

2 结果与讨论

2.1 温度的影响

图1 温度对苯酚降解的影响

图2 苯酚降解速率的阿仑尼乌斯图

在初始苯酚浓度为1000 mg/L，pH值为7的条件下，研究温度对菌株降解苯酚的影响。结果表明(图1)菌株随温度升高其对苯酚的降解效率也会逐渐升高，在35 ℃时达到最大，为70.3%；因温度影响菌株降解苯酚酶活性，在35 ℃以后，降解效率开始下降。微生物细胞内酶可降低生化反应活化焓从而提高反应速率，而活化能与活化焓大致相等。据范特霍夫经验规则可知，反应速率受温度的影响主要体现在速率常数k与绝对温度K的关系上。因此本文基于热力学原理[16,17]，采用阿仑尼乌斯方程对不同温度下菌株降解苯酚的效能进行分析，公式如下：

(2)

上式中：Ea为活化能(KJ/mol)，k为不同温度下的苯酚降解速率(mg/h)，A为前因子，R为理想气体常数(8.314 J/mol/K)。以lnk对T-1作图(图2)，由直线斜率求出活化能Ea为645.33 KJ/mol，前因子A为34.01。

2.2 pH的影响

图3 不同初始pH对苯酚平均降解速率和苯酚降解率的影响

在初始苯酚浓度为1000 mg/L、温度为30 ℃下研究不同pH值对苯酚降解率的作用。细菌的生长状况受外界环境中氢离子浓度的影响。由图3(A)可知，苯酚平均速率随pH值的升高而增加(pH值4为33.56 mg/h； pH值5为35.90 mg/h)，但pH值进一步升高，平均降解速率开始逐渐降低，pH值为7时为24.58 mg/h。在pH值为10时，苯酚几乎没有降解，平均降解速率仅为2.35 mg/h。为了进一步阐述pH值与菌株苯酚降解速率的相互关系，采用公式(3)对此进行分析：

(3)

式中R为苯酚平均降解速率mg/h，Rmax为最大平均降解速率mg/h，KH和KOH均为速率常数。采用公式(3)对图3A中的数据进行模拟得到KH，KOH和Rmax分别为1.6×10-3，1.54 × 10-8和34.10 mg/h，计算得到最佳pH值为5.69 [(pKOH+ pKH)/2]。同理为了说明pH对苯酚降解效率的影响，采用方程(3)对图3(B)中的数据进行非线性回归，得到高的相关系数0.969，表明该模型可以很好的解释pH与苯酚降解率之间的关系。KH，KOH和Rmax分别为1.5 × 10-3，2.28 × 10-8和83.53 %，通过计算得到最佳pH值为5.74[(pKOH+ pKH)/2]，这进一步表明该菌株在酸性条件下对高浓度的苯酚具有良好的降解效果。

2.3 苯酚初始浓度的影响

在温度35 ℃、pH值为7，研究不同初始浓度下(600～1600 mg/L)，菌株对苯酚的降解效能。图4表明，随初始苯酚浓度的增加，菌株降解苯酚所需时间延长。苯酚初始浓度为600 mg/L 、800 mg/L和1200 mg/L 时，菌株降解苯酚所需时间分别为18 h、24 h和36 h。根据图5中的数据可以计算得到苯酚的平均降解率。

图4 不同初始浓度对苯酚去除的影响

图5 不同初始浓度对苯酚平均降解速率的影响

2.4 苯酚降解动力学分析

为了研究初始苯酚浓度对菌株降解是否存在抑制作用，本文采用Monod结合Haldane模型对此进行分析[18,19]，模型如下：

(4)

(5)

μmax=Y·Vmax

(6)

式中：μx为微生物比生长速率(h-1)；μmax为微生物最大比生长速率(h-1)；Vmax为微生物最大比降解速率；Cs为限制性底物的浓度(mg/L)；Ks为Monod生长半饱和系数(mg/L); Ki为底物抑制系数(mg/L)。

由2.3可知，苯酚在不同浓度时对菌体所产生的抑制作用不同。Monod方程适用于第一基质不受抑制的情况，因此低浓度时，对图6(A)中的数据使用非线性最小二乘法，按方程(4)进行拟合，得到动力学参数为：μmax=0.239 h-1，Ks=48.91 mg/L，因此菌株的生长动力学方程为：

(7)

同时以苯酚浓度和菌体质量浓度作图，通过计算斜率，可以得到菌株生长系数Y = 0.455，见图6(B)，由公式(6)得到菌体的降解动力学方程为：

(8)

图6 苯酚降解的动力学图

A—菌株在低浓度下细胞生长动力学；B—菌株在高浓度下的细胞生长动力学；C—菌株在低浓度下的生长系数；D—菌株在高浓度下的生长系数。

高浓度时，由于菌体受到底物的抑制作用，因此用Haldane方程来描述菌体的动力学行为。同理，将图6(C)中的数据将按公式(5)，使用非线性最小二乘法进行拟合，得到动力学参数为：μmax= 0.53 h-1，Ks= 180.1 mg/L，Ki= 306.48 mg/L。因此，菌株的生长动力学方程为：

(9)

同样以苯酚浓度和菌体质量浓度作图，通过计算斜率，可以得到菌株生长系数Y = 0.451，见图9(D)，由公式(6)得到菌体的降解动力学方程为:

(10)

目前相关研究报道的高效苯酚降解菌株存在耐酚浓度低，降解时间长等缺陷，例如醋酸不动杆菌的最佳降解苯酚的浓度仅为300 mg/L，红球菌PNAN5在苯酚浓度为188 mg/L～945 mg/L范围内才能获得良好的降解效率(80%～100%)[7,11]，假单胞菌PD39降解800 mg/L的苯酚需72 h[20]，本研究所筛选出的菌株可在48 h以内将浓度为1400 mg/L的苯酚降解99%以上，表明该菌株能够迅速、高效的降解苯酚，且适用于针对酸性含酚废水。

建立动力学模型能够进一步描述菌株对苯酚的降解能力，为该菌最终走向实际应用提供一定的理论和实践基础。采用Monod方程并结合Haldane方程对苯酚的生物降解过程进行动力力学分析得到低浓度时动力学参数分别为μmax= 0.239 h-1，Vmax= 1.35 h-1，Ks = 48.91 mg/L；高浓度时，动力学参数分别为μmax= 0.53 h-1，Vmax= 1.17 h-1，Ks=180.1 mg/L，Ki=306.48 mg/L。动力学参数值处在文献报道的范围之内[13,18,19]，且在高浓度时，μmax较大，进一步证实该菌株有较强的降解苯酚能力。

3 结论

3.1 温度为35 ℃时菌株降解苯酚的效率最高，活化能Ea为645.33 KJ/mol。pH模型分析表明：pH值为5.69，菌株降解苯酚的最大平均速率达到34.10 mg/h；pH值为5.74时，菌株对苯酚最大降解率达到83.53%。

3.2 初始苯酚浓度在1400 mg/L以下时，菌株经48 h可实现对其完全降解；当苯酚浓度为1600 mg/L时，降解效率达到62.5%，其中当苯酚初始浓度为1200 mg/L时，降解速率最大，为31.87 mg/h。

3.3 低浓度时，菌株降解苯酚符合Monod方程模型，经拟合得到动力学参数分别为μmax= 0.239 h-1，Vmax= 1.35 h-1，Ks = 48.91 mg/L；高浓度时，符合Haldane方程，经拟合得到动力学参数分别为μmax= 0.53 h-1，Vmax= 1.17 h-1，Ks=180.1 mg/L，Ki=306.48 mg/L。

[1]石先阳,孙庆业. 苯酚的厌氧生物转化 [J]. 环境工程学报,2009,3(8):1409-1413.

[2]Fang H H P,Liang D W,Zhang T,et al. Anaerobic treatment of phenol in wastewater under thermophilic condition [J]. Water Research,2006,40:427-434.

[3]赵天亮,陈芳媛,宁 平,等.工业含酚废水治理进展及前景 [J]．环境科学与技术，2008，31(6)：64-66.

[4]朱永光,冯 栩,廖银章,等.活性污泥系统处理苯酚废水的生物强化效果 [J]. 应用与环境生物学报,2006,12(4)：559-561.

[5]Wei G H,Yu J F,Zhu Y H,et al．Characterization of phenol degradation byRhizobiumsp．CCNWTB 701 isolated fromAstragaluschrysopteruin mining tailing region [J]．Journal of Hazardous Materials,2008,151(1):111-117.

[6]Trochimczzuk A W,Streat M,Kolarz B N. Highly polar polymeric sorbents characterization and sorptive properties towards phenol and its derivatives [J]．Reactive and Functional Polymers,2001,46(3):259-271.

[7]陈 明,张 维,徐玉泉,等．醋酸钙不动杆菌PHEA-2对苯酚的降解特性研究 [J]．中国环境科学,2001,21(3):226-229.

[8]Aditi B,Aloke K G．Phenol degradation performance by isolatedBacilluscereusimmobilized in alginate [J]. International Biodeterioration,2011,65(7):1052-1060.

[9]Jiang Y Z,Xiao J Y. Optimization of phenol degradation byCandidatropicalisZ-04 using Plackett-Burm-man design and response surface methodology [J]．Journal of Environmental Sciences,2011,23(1):22-30.

[10]王 强,马沛生,王加宁,等．一株苯酚降解产酸克雷伯菌的分离与鉴定 [J]．中山大学学报(自然科学版),2007,46(06):56-57.

[11]沈锡辉,刘志培,王保军,等．苯酚降解菌红球菌PNAN5菌株(Rhodococcussp. strain PNAN5)的分离鉴定、降解特性及其开环双加氧酶性质研究 [J]．环境科学学报,2004,24(3):482-486.

[12]龚 斌,刘 津,赵 斌．一株高效苯酚降解菌的分离、鉴定及降解特性的研究 [J]．环境科学学报,2006,26(12):2008-2012.

[13]吕荣湖,付 强．高浓度酚降解菌的选育及其降酚性能 [J]．环境科学,2005,26(05):147-151.

[14]Alper N,Beste Y. Modeling of phenol removal in a batch reactor [J]．Process Biochemistry,2005,40(3-4): 1233-1239.

[15]马溪平,艾 娇,徐成斌,等．耐低温苯酚降解菌的降解动力学研究 [J]．环境保护科学,2009,35(05): 18-20.

[16]韩德刚,高盘良．化学动力学基础 [M]．北京: 北京大学出版社,1987,94-102.

[17]Mu Y,Zheng X J,Yu H Q. Biological hydrogen production by anaerobic sludge at various temperatures [J]. International Journal of Hydrogen Energy,2006,31:780-785.

[18]Arutchelvana V,Kanakasabai V,Elangovan R,et al. Kinetics of high strength phenol degradation usingBacillusbrevis[J]. Journal of Hazardous Materials,2006,129 (1-3):216-222.

[19]杨素亮,姜 岩,闻建平. 一株高效苯酚降解菌的分离鉴定及动力学研究 [J]．化学工业与工程,2006,23(4):287-29.

[20]任何山,王 颍,赵化冰,等．酚降解菌株的分离、鉴定和在含酚废水生物处理中的应用 [J]. 环境科学,2008,29(2):482-486.