黄小林， 吕国敏， 刘付永忠， 李 涛， 蔡云川， 马志洲， 黄 忠

(1. 中国水产科学研究院南海水产研究所 农业部南海渔业资源环境重点野外科学观测试验站，广州 510300；2. 广东省水产技术推广总站,广州 510222)

石斑鱼是石斑鱼属(Epinephelus)鱼类的统称，在分类学上隶属于鲈形目(Perciformes)、鲈亚目(Percoidei)、鮨科(Serranidae)、石斑鱼亚科(Epinephelinae)。石斑鱼的种类较多，全世界已记录有100多种，其中，中国有40多种。石斑鱼广泛分布于热带至温带海域，是珊瑚礁中的重要捕食者，在海洋生态中占据着重要地位。该属鱼类多为名贵的食用鱼，部分已成为重要的养殖对象，具有巨大的市场潜力。近年来，由于人类活动的影响：掠夺性开发、过度捕捞、海洋环境的污染和破坏、养殖群体的近亲繁殖、外来种侵入等，鱼类资源日益衰退[1-3]，而石斑鱼个体发育中存在先雌后雄的性转变过程，雄性亲鱼均高龄化(一般6龄以上)[4]，致使其自然资源的减少更加严重，部分种类已被世界自然保护联盟(The World Conservation Union，简称IUCN)收录到《濒危物种红皮书》(IUCN Red List )中，赤点石斑鱼(Epinephelusakaara)等被列为濒危物种[5]。

动物线粒体DNA是核外的遗传物质，具有母系遗传、序列简单、进化速率快等特点，在进化遗传学研究中得到广泛应用。线粒体全基因组序列与单个基因标记相比，前者所包含的信息量更大，能反映出物种在基因组水平的遗传特征，如基因的组成、排布等[6-9]。目前，在GenBank中已登录有6种石斑鱼线粒体基因组序列。本文在6条石斑鱼线粒体基因组研究的基础上，全面分析石斑鱼线粒体基因组的基本结构特征和变异位点，检测蛋白质编码基因在进化过程中受到的选择压力，评估不同基因在石斑鱼系统发育分析中的适用性。本研究旨在为石斑鱼生物多样性保护及其生物资源合理利用等方面提供遗传信息，并为寻找合适的分子标记提供参考。

1 材料与方法

1.1 基因组全序列的获取

从NCBI的GenBank数据库中检索并下载6条石斑鱼属鱼类线粒体基因组全序列及一条相近属(鳃棘鲈属)豹纹鳃棘鲈[3](Plectropomusleopardus)的线粒体基因组全序列(作为外类群构建分子系统树)，其种名及序列的GenBank登录号与相关信息详见表1。

表1 6种石斑鱼属鱼类线粒体基因组的基本信息

1.2 基因组结构和碱基差异性分析

在Genbank中检索统计每个物种基因组序列的长度、结构和基因排布；用MEGA 4. 0[10]中的Clustal W程序进行比对，人工去除末端难于排列的区域，之后用Mega 4.0和DnaSP 5.10[11]统计分析每个基因的变异率和碱基含量等信息。

1.3 非同义替换率( Ka)和同义替换率(Ks)分析

进化速率是受稳定性(负)选择、突变和定向(正)选择控制的[6]。为检验石斑鱼线粒体基因组在进化过程中受到的选择压力，用DnaSP 5.10对蛋白质编码基因进行基于Ka-Ks的Tajima’s D检验(Tajima’s D test)，之后用 McDonald-Kreitman test检验13个蛋白质编码基因的非同义替换率(Ka)与同义替换率(Ks)，计算得出每个蛋白质编码基因非同义替换率(Ka)和同义替换率(Ks)的比值(Ka /Ks)。

1.4 不同基因分析石斑鱼属鱼类系统进化的能力评估

构建分子系统树的方法主要有距离矩阵法、最大简约法及最大似然法三类。其中，距离矩阵法以结构简单、具有良好的理论基础等特点最为广泛。本文所采用的构树方法——邻接法(Neighbor-Joining)是最常见的距离矩阵法之一[12]。

使用Mega 4.0中的邻接法采用Kimura2-Parameter模式构建分子系统树，分支的置信度采用重复抽样分析法(Bootstrap=1000)。参照王中铎等[13]的方法，评估基因组不同区域序列对石斑鱼属鱼类系统进化分析的适用性，该方法主要依据构建NJ树过程中Bootstrap获取的置信度高低判断系统树的可靠性，计算得到单一序列构建系统树的置信度和以及碱基信息量(置信度和/序列长度)，并以13个蛋白质编码基因合并序列构建的系统树为标准树，比较分析线粒体基因组不同区域在系统进化分析中的适用性，除构建13个蛋白质编码基因的单一序列和合并序列的分子系统树外，还利用mtDNA基因组序列(不含D-loop区)、12S rRNA、16S rRNA构建分子系统树。

2 结果

2.1 石斑鱼线粒体基因组的基本特征

6种石斑鱼的线粒体基因组全长在16418bp(斜带石斑鱼)至16795bp (赤点石斑鱼)之间(表1)，基因组结构和排列顺序一致(图1)，均由37个基因(包括13个蛋白质编码基因、2个rRNA基因和22个tRNA基因)和一段控制区序列(D-loop)组成，基因排列紧凑，无内含子。

线粒体全序列在碱基组成上均出现明显的反G偏倚，G+C含量低于A+T含量。线粒体全序列(不含控制区序列)及13个蛋白质编码基因、2个核糖体RNA基因的差异位点分析详见表2，在15个主编码基因中，12S rRNA和16S rRNA基因最为保守，差异位点比例分别为13.6%和13.5%，其次为COX2基因和ND4L基因,差异位点比例分别为20.3%和23. 9%，差异位点比例最高的是ND6基因，高达33.9%。

图1 石斑鱼线粒体基因组的基因排列

表2 石斑鱼属鱼类线粒体基因组及不同区域的序列长度、变异位点数(%)、G+C含量(%)、置信度和(N)及评价

注：表中VG(very good)、G(good)、M(middle)、P(poor)。

2.2 Ka/Ks分析及选择检验

计算得到线粒体13个蛋白质编码基因的Ka/Ks[14]比值见图2，所有13个蛋白质编码基因Ka/Ks均远小于1(0.079～0.448)，说明这13个蛋白质编码基因在进化过程中均受到了强烈的净化选择作用，Tajima’s D检验[15]结果同样表明石斑鱼属鱼类线粒体编码基因受到净化选择的作用(Tajima’s D=-0.8097～-0.05968 P>0.10)。在受到净化选择压力的所有13个基因中，ATP8的Ka/Ks最大(0.448)，表明该基因进化中受到的净化选择压力最小，之后是ND6(Ka/Ks= 0.333)。相反，Cox3和ND3基因的Ka/Ks最小(分别是0.096和0.103)，表明这两个基因在进化中受到的净化选择压力最大。

图2 石斑鱼属鱼类线粒体基因组13个蛋白质编码基因的Ka/ Ks分析

2.3 线粒体基因组不同区域的分子系统树

以同科异属的豹纹鳃棘鲈(P.leopardus)作为外群，构建了基于6种石斑鱼(表1) 线粒体基因组全序列、13种蛋白质编码基因单一序列及合并序列的分子系统树(NJ树)。

图3 线粒体DNA基因组全序列的 NJ 树

图4 蛋白编码基因拼接序列的 NJ 树

线粒体基因组及13种蛋白质编码基因合并序列的NJ树(图3和图4)，由图可见，13个蛋白质编码基因拼接序列所构建的NJ树除置信度和(N=390)略高于线粒体基因组全序列外，两者聚类结构完全一致。同科异属的豹纹鳃棘鲈作为外类群位于树的根部。本文中6种石斑鱼分子系统树结构：褐带石斑鱼与云纹石斑鱼最先聚成一支，再与斜带石斑鱼和鞍带石斑鱼聚成的一支形成姐妹支，之后再依次与七带石斑鱼和赤点石斑鱼聚类。从分子系统树中可以看出，褐带石斑鱼与云纹石斑鱼的亲缘关系较近，斜带石斑鱼和鞍带石斑鱼亲缘关系较近，而赤点石斑鱼和七带石斑鱼是这6种石斑鱼中亲缘关系较远的物种。

基于单一蛋白质编码基因(Cytb、ND2、COX3等)全序列建立的NJ树见图5、图6和图7(其余基因的系统树未列出)，相比13个基因拼接序列构建的标准树(图4)，Cytb和ND2基因的系统树物种聚类关系一致，另外一致的还有ND5、COX2、16SrRNA基因，而COX3及其余基因构建的系统树与标准树的物种聚类关系存在差异。

图5 基于Cytb基因的 NJ 树

图6 基于ND2基因的 NJ 树

图7 基于COX3基因的 NJ 树

2.4 线粒体基因组不同区域的系统发育信息评价

线粒体基因组全序列、13个蛋白质编码基因拼接序列及单基因序列构建的系统树经1000次Bootstraps检验获取的置信度和及每个碱基的平均信息量如表2所示。置信度和最高的是13个蛋白质编码序列合并序列(N=390)，明显高于单基因序列，但其单碱基信息量(N/L=0.03)显著低于所有单基因序列。13种单基因序列中，置信度和最高的是COX3基因(N=355)，其次是Cytb基因(N= 345)和ND2基因(N= 340)，而单碱基信息量最大的是ATP8基因(N/L = 1.31)。COX3基因虽然有着单基因序列中最高的置信度和(N= 355)，但基于其构建的分子系统树(图7)与标准树(图4) 结构不一致，故而不能作为石斑鱼属系统进化分析中的理想分子标记。而对于ND3、ND4L、ND6等基因，虽然单碱基的信息量较大，但是由于其系统树的置信度和低，因此也不能作为石斑鱼属系统进化分析中的理想分子标记。在种群遗传的研究中，分子标记的选择是至关重要的。综上所述，对于石斑鱼属内不同种间的系统发育分析，线粒体基因组不同区域的适用情况为: 最好的是Cytb和ND2基因，其次是ATP6和12S rRNA基因，ND4和COX2基因较差，其余基因表现中等。

3 讨论

石斑鱼属鱼类线粒体基因组结构同大多数脊椎动物一样[16]，包含13个蛋白质编码基因，2个rRNA基因，22个tRNA基因和1个非编码控制区。

非同义替换率(Ka)和同义替换率(Ks)的比值(Ka/Ks)常用来检验蛋白质编码基因所受选择压力。若Ka/Ks>1，即分析序列中非同义替换多于同义替换，表明该基因受到阳性选择(适应性选择)；如果Ka/Ks=1，则说明该基因处于中性进化；而当Ka/Ks<1时，则表明该基因受到负选择(纯化选择)[6,9]。本文研究的石斑鱼属鱼类线粒体基因组中，所有13个蛋白质编码基因的Ka/Ks(图2)均远小于1，都显示出较强的净化选择作用。田美等[17]对短尾派(Brachyura)线粒体基因组，Shen等[18]对中国明对虾(Fenneropenaeuschinensis)、南美白对虾(Litopenaeusvannamei)、罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii)、脊尾白虾(Exopalaemoncarinicauda)及Halocaridinarubra的线粒体基因组，Wu等[19]对金线鲃(Sinocyclocheilusgrahami)、S.altishoulderus、岩原鲤(Procyprisrabaudi)及鲤(Cyprinuscarpio)的线粒体基因组等研究均发现线粒体的13个蛋白质编码基因均受到不同强度的净化选择作用。而田美等[23]在研究海胆纲粒体基因组时发现ATP8基因(Ka/Ks=1.373>0)存在阳性选择(适应性选择)，这在海洋无脊椎动物线粒体基因组中为首次报道。另外张丽丽等[9]对鳀科鱼类线粒体全基因组研究时也发现ND6基因(Ka/Ks=1.139>0)存在阳性选择(适应性选择)。在该研究中，同样发现石斑鱼属鱼类线粒体基因组中ATP8和ND6两个基因的Ka/Ks比值是最高的(分别为0.448和0.333)。

本文中石斑鱼属线粒体基因组序列(不含控制区)构建的系统树的置信度和比蛋白质编码序列构建的系统树的置信度和低，这与张丽丽等[9]的结果相一致，其认为这可能是由于线粒体基因组序列中存在一些具有较差信息的基因，在构建分子系统树的过程中形成噪音，从而影响分子系统树的准确性。

表3 mtDNA蛋白编码基因适用性

注：表中VG(very good)、G(good)、M(middle)、P(poor)。

线粒体基因组中不同基因在进化过程中受到的选择压力强弱不同，导致其进化速率也有差异，因而不同基因序列所包含的系统发育信息也不尽相同[14]。Zardoya R等[20]、陈姝君等[21]、郭昱嵩等[22]、王中铎等[13]及张丽丽等[9]分别基于脊椎动物、硬骨鱼类、鲈形目、鳀科以及笛鲷属等不同分类阶元评估线粒体蛋白质编码基因在系统发育分析时的信息量(表3)。与前人研究结果相比，本文的研究结果总体上一致，但在某些基因上也存在差异，如前人研究中均认为适用性好或中等的COX2和ND4基因在本研究中被评估为差，作者认为这是由于在评估一个基因的适用性时没有一个统一的参数，都只是相对自己研究物种的各个基因做出的评价，因此在做横向比较时缺乏一个标准可供参照。另外，本文的研究结果与王中铎等[12]研究的笛鲷属比较接近，作者认为这是由于这两个研究的对象都是同一阶元(属)的缘故，这说明在系统发育分析时不同阶元应选择不同的基因作为分子标记，本文通过石斑鱼属与同阶元及不同阶元的比较揭示了线粒体基因组中不同基因进化的规律，对于实际应用中根据分类阶元选择合适基因作为分子标记将有一定指导意义。

[1]尹绍武，黄 海，张 本，等．石斑鱼遗传多样性的研究进展[J]．水产科学，2005，24(8)：46-49．

[2]吴晓菲，尹绍武，陈国华，等．石斑鱼染色体研究进展[J]．水产科学，2008，27(10)：550-552．

[3]中国科学院动物研究所．南海鱼类志[M]．北京：科学出版社，1962．

[4]邹记兴，胡超群，肖耀兴，等．石斑鱼性控技术与育苗现状及产业化概述[J]．水利渔业，2000，20(2)：1-3．

[5]世界自然保护联盟．《濒危物种红皮书》(IUCN Red List )[DB/OL]，2012．

[6]田 美，申 欣，孟学平，等．鲸类线粒体基因组特征分析及分子标记探讨[J]．海洋学报，2011，33(5)：104-114．

[7]庄 轩，丁少雄，郭 丰，等．基于细胞色素b基因片段序列研究中国近海石斑鱼类系统进化关系[J]．中国科学 C 辑 生命科学，2006，36(1)：27-34．

[8]陈艺燕，章 群，任 岗，等．10种石斑鱼系统发育的线粒体细胞色素b基因序列分析[J]．海洋科学，2006，30(6)：12-15．

[9]张丽丽，程起群．鳀科鱼类线粒体全基因组序列结构特征及系统发育信息分析[J]．海洋渔业，2012，34(1)：7-14．

[10]Tamura K,Dudley J,Nei M. MEGA4: molecular evolutionary genetics analysis (mega) software version 4.0[J]. Molecular Biology and Evolution,2007(24): 1596-1599.

[11]Librado P,Rozas J. DnaSP v5: A software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data[J]. Bioinformatics,2009,25(11): 1451-1452.

[12]高 凯．NJ 进化树构建方法的改进及其应用[D]．北京：北京工业大学，2008．

[13]王中铎，谭 围，郭昱嵩，等．笛鲷属线粒体基因组编码序列的系统进化分析能力评估[J]．水产学报，2010，34(6)：836-844．

[14]Hurst L D. The Ka /Ks ratio: diagnosing the form of sequence evolution[J]. Trends Genet,2002(18): 486-487.

[15]Tajima F. Statistical method for testing the neutral mutation hypothesis by DNA polymorphism[J]. Genetics,1989(123): 585-595.

[16]Meyer A. DNA technology and phylogeny of fish[M]. London: Chapman and Hall,1994: 219-249.

[17]田 美，申 欣，孟学平，等．短尾派线粒体基因组特征及基因差异位点分析[J]．水产科学，2011，30(1)：31-37．

[18]Shen X,Ren J F,Cui Z X. The complete mitochondrial genomes of two common shrimps (Litopenaeus vannamei and Fenneropenaeus chinensis) and their phylogenomic considerations[J]. Gene,2007(403): 98-109.

[19]Wu X Y,Wang L,Chen S Y. The complete mitochondrial genomes of two species from Sinocyclocheilus (Cypriniformes:Cyprinidae) and a phylogenetic analysis within Cyprininae[J]. Molecular Biology Reports,2010(37): 2163-2171.

[20]Zardoya R,Meyer A. Phylogenetic performance of mitochondrial protein-coding genes in resolving genes in resolving relationships among vertebrates[J]. Molecular Biology and Evolution,1996,13(7): 933-942.

[21]陈姝君，赫崇波，木云雷．硬骨鱼类线粒体基因系统发育信息效率分析[J]．中国水产科学，2008，15(1)：12-21．

[22]郭昱嵩，王中铎，焦 阳．鲈形目线粒体DNA蛋白编码基因的适用性分析[J]．安徽农业科学，2009，37(16)：7355-7358．

[23]田 美，申 欣，孟学平，等．海胆纲线粒体基因组特征及基因差异位点分析[J]．水产学报，2011，30(3)：174-176．