石 芸， 姚 敏， 侯连国， 李 静， 杨 原， 姜玲玲

(1．河北医科大学生物化学与分子生物学研究室， 石家庄 050017；2．河北省人民医院， 石家庄 050017)

β-淀粉样蛋白(beta-amyloid peptide，Aβ)生成增多和在脑内的沉积是阿尔茨海默病(alzheimer’s disease，AD)发生发展的关键因素。因此，探究Aβ生成的影响因素，对防治AD有着十分重要的意义。

研究表明，Aβ的产生和沉积与脑胆固醇的代谢有密切的关系。由于血脑屏障的存在，脑细胞内胆固醇的水平只与其原位合成量和转出量有关[1]。羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA redactase，HMG-CoAR)是胆固醇合成的限速酶，其活性决定了脑胆固醇的合成量。用他汀类药物特异性地抑制HMG-CoAR的活性，降低胆固醇的合成，可明显降低神经细胞的Aβ水平[2]。肝X受体(liver X receptor，LXR)是一种核受体，与其相应的配体结合活化后，可上调靶基因ATP盒转运体A1(ATP binding cassette transporter A1,ABCA1)的表达，增加细胞内胆固醇向细胞外载脂蛋白的转移，降低胞内胆固醇水平[3]。用LXR的激活配体处理转基因的AD模型小鼠和小鼠海马细胞后，ABCA1被明显诱导表达，脑胆固醇降低，有效地降低了Aβ的水平[4， 5]。已知，正常鼠与转基因鼠有着不同的基因背景，LXR的激活配体对正常鼠是否有同样的效果？另外，脑中胆固醇是经神经元细胞内胆固醇-24S-羟化酶(cholesterol-24S-hydroxylase，CYP46)转化为24S-羟基胆固醇后通过血脑屏障出脑的[6， 7]。而细胞胆固醇通过胞内的ABCA1、ABCG1转出细胞外，呈递给apoE等载脂蛋白后[8]，只在脑内转移[9， 10]。因此，上述LXR被激活上调ABCA1时，脑总胆固醇的降低是否与CYP46的转录上调有关？未见报道。

为此，本实验以C57BL/6J小鼠为实验对象，用人工合成配体TO901317激活LXR，观察脑Aβ和胆固醇水平以及CYP46 mRNA表达的变化，探讨LXR激活对脑胆固醇和Aβ水平的影响，为寻找预防AD的药物提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 动物

8～10周龄成年雄性C57BL/6J小鼠20只，体重20～25 g，由北京实验动物中心提供。

1.2 主要试剂

TO901317购自cayman公司；Trizol购自Invitrogen；反转录试剂盒购自Promega；Taq DNA聚合酶购自鼎国生物公司；总胆固醇测定试剂盒购自上海荣盛生物技术有限公司；Aβ放免测定试剂盒购自北京301放免研究所；其它试剂为国产分析纯或优级纯。所用引物由上海捷倍思基因技术有限公司根据设计合成，见表1。

表1 引物序列

1.3 主要方法

1.3.1 动物分组及取材

将小鼠随机分为2组：对照组(Con组，10只)和激动剂组(TO组，10只)。将LXR激动剂TO901317溶于二甲基亚砜中(25 mg/mL)，用1%羧甲基纤维素按体积比1∶150稀释后，予以TO组鼠灌胃(20 mg/kg/d)。Con组鼠给予不含TO901317的其它组分相同的上述液体灌胃。小鼠连续灌胃7 d后，禁食不禁水一晚，10%水和氯醛麻醉，断头处死，取脑组织于液氮冷冻后，-70℃超低温冰箱保存备用。

1.3.2 脑组织Aβ的测定

[11]的方法，称取80 mg左右的脑组织，加入1200 uL 70%甲酸，冰浴匀浆，匀浆液在4℃，12000 r/min离心30 min，取上清液400 uL，加入1 mol/L Tris-HCl 3.6 mL (pH值8.0)稀释10倍，充分混匀，4℃，12000 r/min离心30 min，去除沉淀，用于Aβ的测定。用试剂盒测定其Aβ含量后，用改良Lowry法定量总蛋白，算出每毫克总蛋白内所含的Aβ的量，用pg/mg表示。

1.3.3 脑组织中胆固醇含量的测定

准确称取脑组织，按1 g组织加29 mL氯仿/甲醇(2∶1 V/V)溶液的比例，冰浴匀浆，匀浆液3000 r/min离心5 min，留取上清液；沉淀中再加氯仿/甲醇(2∶1 V/V)溶液(第一次用量的2/3量)，匀浆，3000 r/min离心5 min后留取上清，合并两次留取的上清液。取适量上清液，按2 mL上清加入1 mL含2% Triton X-100的氯仿溶液的比例混匀，60℃水浴蒸干，将蒸干样品复溶于三蒸水中，用于胆固醇的测定。按试剂盒说明书测定胆固醇含量后，计算出每克脑组织中胆固醇的含量，用mg/g表示。

1.3.4 RT-PCR

采用Trizol法分离纯化脑组织的总RNA，分光光度法测定计算提取的总RNA含量及浓度。用随机引物进行逆转录，以逆转录的单链cDNA为模板进行PCR，总反应体积25 μL，其中10×PCR buffer 2.5 μL，10 mmol/L dNTP Mix 0.5 μL，Taq DNA聚合酶2 U，cDNA 1.5 μg，引物 0.5 μmol/L。扩增条件为：95°C 预变性2 min，94°C变性1 min，55°C 45 s (for β-actin)，or 62°C 45 s(for ABCA1)，or 59°C 45 s(for CYP46)，72°C 60 s，30个循环，72°C 延伸5 min。然后，取RT-PCR产物8 μL，在2%琼脂糖凝胶上电泳，70 V 40 min，凝胶图像成像系统拍摄保存实验结果，凝胶图像分析系统(江苏捷达科技发展公司)分析各目的基因与β-actin基因条带吸光度的比值，以此作为目的基因的相对表达量。

1.3.5 统计学处理

2 结果

2.1 小鼠脑LXR下游基因ABCA1 mRNA表达的变化

激动剂组(TO)ABCA1的mRNA相对表达量比对照组(Con)明显增高(P<0.01)，见图1，表明LXR被激动剂激活。

图1 RT-PCR检测激动剂组和对照组大鼠脑中LXR下游基因ABCA1 mRNA的表达水平

2.2 小鼠脑Aβ含量的变化

激动剂组(TO)Aβ的含量较对照组(Con)有所降低(P<0.05)，见图2，提示激活LXR有效地降低了小鼠脑Aβ的含量。

2.3 小鼠脑总胆固醇含量的变化

激动剂组(TO)的总胆固醇含量较对照组(Con)降低(P<0.05)，且脑总胆固醇含量与Aβ的含量呈正相关(r=0.57，P<0.05)，见图3，表明激活LXR引起的Aβ含量减少与脑胆固醇的降低有关。

图2 放免法检测激动剂组和对照组大鼠脑中Aβ的水平

图3 A. 酶法检测激动剂组和对照组大鼠脑中胆固醇的含量；B. 大鼠脑胆固醇和Aβ含量的相关性分析

2.4 小鼠脑胆固醇-24S-羟化酶CYP46 mRNA的表达变化

激动剂组(TO)CYP46 mRNA的相对表达量较对照组(Con)明显增高(P<0.01)，见图4，CYP46 mRNA的相对表达量与脑胆固醇的含量呈负相关(r=-0.87，P<0.01)。表明LXR的激活伴随CYP46 mRNA表达增加，后者与胆固醇的降低有关。

图4 A. RT-PCR检测激动剂组和对照组大鼠脑中CYP46 mRNA的表达水平；B. 大鼠脑胆固醇和CYP46 mRNA表达的相关性分析

3 讨论

Aβ由β-淀粉样前体蛋白(β-amyloid precursor protein，AβPP)经β-，γ-位点的AβPP内切酶催化裂解产生。AβPP的β-位点以及β-位点的内切酶位于细胞膜的脂筏中[12]。胆固醇是细胞膜、神经髓鞘的重要组成成分，具有调节细胞膜的通透性、流动性以及物质的转运等功能。减少细胞的胆固醇可以提高膜流动性，从而减少β-位点内切酶的活性，有效地减少Aβ的生成和聚集沉积量[13]。激活转基因的AD模型小鼠LXR后，脑胆固醇水平降低，脑Aβ降低，缓解了AD的病理过程[14]。与上述报道一致，本实验中，我们用TO901317激活正常小鼠LXR后，脑内胆固醇与Aβ也被明显降低。

由于胆固醇不能自由通过血脑屏障，脑组织的胆固醇几乎都是由神经元和神经胶质细胞自身合成[1]。脑内64%以上的胆固醇也需在神经元细胞内经CYP46将其转化为24S-羟基胆固醇后通过血脑屏障出脑[6]。而脑细胞的胆固醇通过胞内的ABCA1、ABCG1转出细胞外，呈递给apoE等载脂蛋白，只在脑内的转移[8-10]，或转到神经元细胞被羟化成24S-羟基胆固醇后通过血脑屏障，或是转到需要胆固醇的部位[1]。本实验结果显示，TO901317激活LXR后，不仅LXR的靶基因ABCA1转录增强，CYP46的转录也同时明显上调，并且CYP46 mRNA的相对表达量与脑总胆固醇含量呈负相关。这表明，伴随LXR激活所发生的脑胆固醇下降，与胆固醇经ABCA1出胞，以及经24S-羟胆固醇途径出脑的机制同时被上调有关。证明，CYP46有可能在激活LXR降低脑胆固醇，降低Aβ的过程中发挥重要作用。

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