马 力,杨丽梅,王 艳,郭时金,沈志强*, 张 颖

(1. 山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州256600；2. 山东绿都安特动物药业有限公司，山东，滨州256600)

兔病毒性出血症(Rabbit hemorrhagic disease，RHD)俗称兔瘟，是由兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV)引起的兔的一种烈性、急性、毁灭性、高度接触性传染病[1-2]，该病于1984年在我国江苏地区首次爆发后，迅速向全世界范围内扩散，现已呈全球性流行，具有传播速度快、高发病率和高死亡率等主要流行特征，该病被世界动物卫生组织列为B类动物传染病，被我国农业部兽医局列为二类动物疫病[3-8]。本研究对兔出血症病毒ZB分离株的VP60基因进行了序列分析以及VP60蛋白的主要抗原区域进行了原核表达与鉴定，旨在丰富我国RHDV地方分离毒株资源，为RHDV分子流行病学调查提供参考，为VP60蛋白结构与功能研究、RHDV抗体检测试剂盒及新型疫苗的研制奠定基础。

1 材料和方法

1.1 菌毒株、载体及血清

克隆菌株DH5α感受态细胞、表达菌株BL21(DE3)由山东省滨州兽医生物技术重点实验室制备并保存；兔出血症病毒ZB分离株由山东省滨州兽医生物技术重点实验室分离并保存(将在另文发表)；原核表达载体pET30a由山东省滨州兽医生物技术重点实验室保存；兔病毒性出血症阳性血清与阴性血清由山东绿都生物科技有限公司提供。

1.2 主要试剂与试剂盒

rTaq酶、Hind III、BamH I内切酶、T4 DNA连接酶购自宝生物(大连)工程有限公司；镍离子亲和层析柱购自GE Healthcare；病毒基因组RNA提取试剂盒、凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司。

1.3 引物设计与合成

根据Genbank登录兔出血症病毒基因组序列(Genbank登录号：JN851734.1)，设计扩增VP60蛋白的一对特异性表达引物：F1 5'-3' ATAGGATCCGGCATGC AGTTCCGCTTCAT；R1 5'-3' ATTCAAGCTTCTACGGCATAAATGGGCTTAG，(下划线部分表示引入的BamH I/Hind III酶切位点)，该对引物扩增VP60基因345 bp至1 221 bp的主要抗原区域，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 分离病毒基因组RNA的提取及cDNA合成

取分离病毒200 μL，按RNA抽提试剂盒的使用说明提取病毒基因组RNA，分离病毒基因组RNA为模板，按M-MLV酶说明进行cDNA合成。

1.5 目的基因片段的PCR扩增及表达载体的构建与鉴定

以测序正确的pMD-VP60重组质粒为模板，用设计的表达引物(F2/R2)进行表达基因片段的PCR扩增，PCR反应参数为：95 ℃ 5 min，95 ℃ 1 min、58 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min、35个循环，72 ℃10 min，4 ℃终止反应。PCR扩增产物经纯化后，利用BamH I/Hind III双酶切后胶回收试剂盒回收基因片段，连接至经BamH I/Hind III双酶切纯化的pET30a原核表达载体中，转化克隆菌株DH5α感受态细胞，提取质粒DNA，用BamH I/Hind III双酶切鉴定，鉴定正确的阳性质粒命名为pET30a-VP60，将其送测序公司进行序列测定，以验证其阅读框架是否正确。

1.6 VP60重组蛋白的诱导表达与表达形式鉴定

将鉴定正确的pET30a-VP60阳性重组质粒转化表达菌株BL21(DE3) 感受态细胞，挑取单菌落，加5 mL LB液体培养基过夜增菌，次日取2 mL加入至含200 mL LB液体培养基的三角锥形瓶中，于37℃摇床中培养至OD600值约为0.7时，加入200 μL浓度为1 mol/L的IPTG，继续诱导5 h后离心收集菌液，经超声波破碎后以10 000 r/min离心10 min，收集上清与沉淀进行SDS-PAGE电泳检测分析，鉴定目的蛋白的表达形式。

1.7 VP60重组蛋白的纯化

用8 mol/L尿素溶解以包涵体形式表达的重组蛋白，包涵体溶解后按GE Healthcare公司的镍离子亲和层析柱使用说明纯化溶解的包涵体蛋白，重组蛋白过柱纯化后，梯度透析复性，复性结束后进行SDS-PAGE电泳检测分析鉴定蛋白的纯化效果。

1.8 VP60重组蛋白的活性鉴定

取纯化的pET30a-VP60重组蛋白与pET30a空载体诱导表达菌经SDS-PAGE电泳后转印至硝酸纤维素膜，经5%脱脂奶粉封闭后，分别与兔病毒性出血症阳性血清与阴性血清(1∶100倍稀释)反应，洗涤后，与辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG(1∶4000倍稀释)反应，洗涤后，利用3,3'-二氨基联苯胺底物缓冲液进行显色。

1.9 间接ELISA检测方法的建立与初步应用

以纯化的重组VP60蛋白作为包被抗原、兔出血症病毒阳性与阴性血清蛋白作为一抗、HRP标记兔抗鸭酶标抗体为二抗，采用方阵滴定法测定抗原抗体的最佳工作浓度与作用时间，以建立的间接ELISA检测方法与血凝抑制试验同时对116份兔血清进行检测，计算二者的符合率。

2 结 果

2.1 VP60表达基因片段的RT-PCR扩增与表达载体的鉴定

用设计的表达引物(F1/R1)对RHDV基因组进行RT-PCR扩增，得到了预表达的876 bp特异性DNA条带(见图1)。PCR扩增产物定向克隆至pET30a构建的pET30a-VP60原核表达载体经BamH I/Hind III双酶切鉴定得到5 900 bp和876 bp两条片段(见图2)，与预期结果相符，测序结果表明其阅读框正确，表明表达载体构建成功。

2.2 VP60重组蛋白的诱导表达

图1 RT-PCR扩增结果Fig. 1 Result of PCR AmplificationM.DNA标准DL 2 000；1.RT-PCR扩增产物；2.对照M.DNA Marker DL 2000;1.Product of RT-PCR;2.control

图2 表达载体酶切鉴定Fig. 2 Identification of recombinant expression vectorM.DNA标准DL15000;1-3.质粒pMD-VP60 BamH I/Hind III酶切M.DNA Marker DL 15000;1.Recombinant expression vector digested by BamH I/Hind IIII.

如图3所示，pET30a-VP60阳性重组质粒在表达菌株BL21(DE3) 中得到了正确表达，重组蛋白以包涵体形式表达，表达蛋白的分子量约为40 ku，与预期相符。

2.3 VP60重组蛋白的纯化结果

以包涵体形式表达的重组蛋白用8 mol/L尿素溶解后，采用镍离子亲和层析柱对其进行过柱纯化后，梯度透析复性，如图4所示，SDS-PAGE电泳检测表明蛋白纯化效果较好，纯度较高。

2.4 VP60重组蛋白的活性鉴定结果

图3 重组蛋白的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of recombination protein

M.蛋白分子质量标准;1.Pet30a表达产物对照;2.Pet30a-VP60未诱导对照;3.Pet30a-VP60表达产物;4.超声破碎后沉淀;5.超声破碎后上清

M.Protein molecular weight Marker;1.Expression product of Pet30a;2.Non induced control of Pet30a-gD;3.Expression product of Pet30a-gD;4.Pellets after ultrasonic disruption;5.Supernatant after ultrasonic disruption

图4 纯化蛋白SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of purified protein

M.蛋白分子质量标准;1.纯化蛋白

M.Protein molecular weight Marker;1.Purified protein

图5 重组蛋白的活性鉴定Fig.5 Western blot of expressed products

1.纯化蛋白与阳性血清作用;2.pET30a表达菌与阳性血清作用; 3.纯化蛋白与阴性血清作用; 4.pET30a表达菌与阴性血清作用

1.Purified protein react with positive serum; 2.Control of pET30a with positive serum.3.Purified protein react with negative serum; 4.Control of pET30a with negative serum.

如图5所示，重组VP60纯化蛋白能与兔病毒性出血症阳性血清反应较好，与兔病毒性出血症阴性血清不发生任何反应，而pET30a空载体诱导表达菌与兔病毒性出血症阳性血清、阴性血清反应均不发生任何反应，重组VP60纯化蛋白表现出了良好的特异性与反应活性。

2.5 间接ELISA检测方法的建立与应用结果

经过方阵滴定试验确定重组抗原最佳包被浓度为3.08 μg/mL；血清最佳稀释度为1∶100，酶标二抗最佳工作浓度为1∶5000，最佳作用时间为37 ℃ 1 h，以建立的间接ELISA检测方法与血凝抑制试验检测116份兔血清样品，间接ELISA检测出阳性86份，阳性率为74.1 %；血凝抑制试验检测出阳性82份，阳性率为70.7 %。二者检测均阳性的样品为80份，均阴性的样品28份，二者的符合率为93.1%，建立的间接ELISA方法表现出了良好的准确性与实用性。

3 讨 论

目前，兔病毒性出血症是危害养兔业最为严重的动物疫病，可给感染兔群带来毁灭性的灾难，严重阻碍了我国养兔业的健康发展，故应持续加强对兔病毒性出血症病毒序列变异分析、抗体普查监测等分子流行病学与血清学诊断等研究工作。目前常用的RHDV抗体检测方法是血凝抑制试验(HI)，HI试验需要人“O”型红血球，血清需经过吸附处理，过程较为繁琐；结果判定易受许多主、客观因素的影响，所以在实际应用中受到很多限制。而ELISA诊断方法具有特异性和敏感性强、快速、准确、通量高等特点，是动物传染病检疫、免疫抗体水平监测和流行病学调查广泛采用的诊断技术。目前由于尚没有体外培养RHDV的细胞系，RHDV诊断试剂的抗原均来源于感染兔的肝脏组织，由于组织毒抗原制备过程繁琐、纯化难度大，同时存在散毒的危险，也不符合动物福利的要求，使利用分子生物学技术获得基因工程抗原成为RHDV新型诊断试剂与疫苗研究的热点。故本研究在成功获得RHDV ZB株VP60全基因序列后，设计合成特异性表达引物，利用pET30a原核表达系统成功表达了RHDV ZB株VP60蛋白主要抗原区域，经镍离子亲和层析纯化方法获得了纯度良好的重组VP60蛋白，免疫印迹鉴定表明该重组VP60蛋白能与兔病毒性出血症阳性血清发生特异性反应，而与兔病毒性出血症阴性血清不发生任何反应，表现出了良好的特异性与反应活性，以该蛋白作为诊断抗原，建立了检测兔瘟病毒抗体的间接ELISA诊断方法，该间接ELISA诊断方法与血凝抑制试验的符合率高达93.1 %，表现出了良好的准确性与实用性。本研究中基因工程抗原的成功获得与间接ELISA抗体检测方法的成功建立，将为进行VP60蛋白结构与功能研究、RHDV抗体检测试剂盒及新型疫苗的研制奠定重要基础。

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