黄 英，李永能，杨明华，潘洪彬，赵素梅*，高士争*

(1.云南农业大学 云南省动物营养与饲料重点实验室，云南 昆明650201；2. 云南农业大学 招生就业处，云南 昆明 650201)

乌金猪是云南省优良的地方猪种之一，具有耐粗饲、适应性强、肉质优良、肌内脂肪丰富等优良性状[1]，但乌金猪繁殖力低、生长慢、瘦肉率低。长期以来乌金猪的饲养主要采用传统的饲养模式进行，对其优良的肉品质性状所需的日粮适宜营养水平缺乏研究，使其优良的肉品质性状未得到充分、科学、合理的利用。本文以乌金猪适宜能量与蛋白水平研究结果为依据，配制WJ日粮，以美国NRC(1998)推荐的主要营养需要量为依据，配制NRC日粮，研究两种日粮对乌金猪不同生长阶段脂肪组织脂类分解代谢相关基因表达的影响，探讨不同营养水平日粮对乌金猪脂肪组织脂类分解代谢的分子机制，为进一步研究乌金猪脂肪沉积过程中脂类分解代谢的变化规律提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物及试验设计

选取体重约23 kg的乌金猪36头，公母各半，随机分为2个处理组，每组设3个重复，每个重复6头。分三个生长阶段，分别于30 kg、60 kg和100 kg体重时屠宰取皮下脂肪组织，-80 ℃保存备用。

1.2 试验日粮

以乌金猪适宜能量与蛋白水平研究结果为依据，配制WJ日粮见表1，表3；以美国NRC(1998)推荐的主要营养需要量为依据，配制NRC日粮见表1。

由表1,2可看出，WJ是按照乌金猪最优肉品质日粮适宜的能量与蛋白水平(15～30 kg、30日粮来说，WJ是一种低能量低蛋白型日粮。

表1 乌金猪营养需要量与美国NRC(1998)推荐的营养需要量表Tatble 1 Nutritional requirement of Wujin pig (88% DM)

表2 日粮组成与营养水平(%，Mcal/kg)Table 2 Diet composition and nutrient levels

注：复合预混料组成：一水硫酸锌2.8%，一水硫酸锰2.74%，一水硫酸亚铁4.03%，五水硫酸铜6.00%，碘化钾0.46%，亚硒酸钠0.65%，维生素A 0.01%，维生素D30.01%，维生素E 0.44%，维生素K 0.01%，维生素B10.01%，维生素B20.03%，泛酸0.08%，烟酸0.10%，维生素B120.05%，生物素0.15%，叶酸0.01%，胆碱8.0%，沸石粉74.42%。

Note： Premix composition contains: Zn 2.8%, Mn 2.74%, Fe 4.03%, Cu 6.00%, I 0.46%, Se 0.65%，VA 0.01%, VD30.01%, VE 0.44%, VK 0.01%, VB10.01%, VB20.03%, pantothenic acid 0.08%, nicotinic acid 0.10%, VB120.05%, biotin 0.15%, folic acid 0.01%, choline 8.0%, Zeolite pouder 74.42%

1.3 总RNA提取

取皮下脂肪组织100 mg，用异硫氰酸胍-酚-氯仿提取总RNA，用紫外分光光度计(260 nm)测定总RNA浓度与纯度，OD260/OD280=1.8～2.0，并经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性后使用。

1.4 实时定量PCR

根据所测定的浓度，各取2 μg总RNA进行反转录，反应体积为20 μL，其中含有：12 μmol/L 随机引物，0.5 mmol/L dNTP，20U RNA 酶抑制剂 (RNase inhibitor)，10 U 反转录酶(M-MLV RTase)，4 μL 5×RT Buffer (含250 mmol/L Tris-HCl pH8.3, 50 mmol/L MgCl2,250 mmol/L KCl, 50 mmol/L DTT, 2.5 mmol/L Spermidine)。先加RNA模板，dNTP和随机引物，70 ℃变性 5 min，立即放冰上冷却，再加其余试剂， 42 ℃反应 60 min，95 ℃灭活 5 min。反转录后的cDNA单链可于-20 ℃中保存。

目的基因：激素敏感脂酶(hormone-sensitive lipase, HSL)、脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase, LPL)、肉碱棕榈酰转移酶1(carnitine palmitoyltransferase-1, CPT-1)和过氧化物酶体增殖物激活受体γ(preoxisome proliferator-activated receptor γ, PPARγ)与内参基因18 s，所有基因的引物使用Primer Primer 5软件设计，由上海生物有限公司合成。基因登录号及引物序列见表3。

表3 内参基因与目的基因的引物序列、产物长度和登陆号Table 3 Specific primers used for RT-PCR

Real-time PCR反应体系为20 μL：1.5 μL反转录产物，10 μL SYBRμ Premix Ex TaqTM，10 mmol/L的基因引物各0.4 μL，加20 μL ddH2O。每样品做2次重复，同时用ddH2O代替RT产物和荧光试剂作空白对照，以检验是否有外源基因和基因组DNA 污染。各基因PCR的优化条件见表4。

表4 实时荧光定量PCR条件Table 4 Conditions for real-time PCR

1.5 定量方法

采用Real-time PCR对各基因的表达进行相对定量，选择18S rRNA为内标基因，根据下列公式计算基因表达量。公式如下：

sample表示最适日粮组样本的CT值，calibrator表示NRC日粮组的CT值。目标基因和内标基因(18S rRNA)的平均CT值被用于上公式。通过上式计算出每一个样本目标基因表达通过18S rRNA均一化处理后相对于NRC日粮组30 kg体重(设为1倍量)时的倍数。

1.6 数据分析

采用SAS9.0和Excel2003软件对试验数据进行统计分析，所有数据表示为平均值±标准差，并对平均值进行方差分析，作显著性检验(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 HSL基因的相对表达水平

在各个屠宰体重，WJ日粮组HSL基因相对表达量均高于NRC日粮组(P>0.05，见图1)。

2.2 LPL基因的相对表达水平

在各个屠宰体重，WJ日粮组 LPL基因相对表达量均显著高于NRC日粮组(P<0.05，见图2)。

图1 HSL基因相对表达量Fig. 1 The expression levels of HSL gene

2.3 CPT-1基因的相对表达水平

30 kg和60 kg屠宰体重，WJ日粮组CPT-1基因的相对表达量显著高于NRC日粮组(P<0.05)，

图2 LPL基因相对表达量Fig. 2 The expression levels of LPL gene

注：相同屠宰体重字母不同，差异显著(P<0.05)，下图同。

Note： For the same slaughtering body weight, different letters indicate significant difference(P<0.05), the same below.

在100 kg屠宰体重，WJ日粮组CPT-1基因的相对表达量低于NRC日粮组(P>0.05，见图3)。

2.4 PPARγ基因的相对表达水平

在各个屠宰体重，WJ日粮组PPARγ基因的相对表达量均高于NRC日粮组，在30 kg屠宰体重达到显著水平(P<0.05，见图4)。

图3 CPT-1基因相对表达量Fig. 3 The expression levels of CPT-1 gene

图4 PPARγ基因相对表达量Fig. 4 The expression levels of PPARγ gene

3 讨 论

本试验以乌金猪为研究对象，围绕营养水平进行系列研究，确定了最适营养水平标准，探讨营养对肉品质形成的相关机理。前期研究分别设立不同的能量和蛋白水平的日粮，用不同能量水平和乌金猪的生产性能和胴体组成建立相关性，通过模糊综合评定，确定15～30 kg、30～60 kg和60～100 kg生长阶段乌金猪最优肉品质日粮适宜的能量水平，分别为13.01 MJ/kg、13.08 MJ/kg和13.11 MJ/kg[2-3]；用不同蛋白水平和乌金猪肉品质的三个指标(滴水损失、剪切力和肌内脂肪含量)建立相关性，通过模糊综合评定，确定15～30 kg、30～60 kg和60～100 kg生长阶段乌金猪最优肉品质日粮适宜的蛋白水平，分别为15.88%、14.13%和11.42%[4-5]。目前很多资料对脂类代谢调节因子与脂肪组织脂类代谢之间的关系进行了研究[6-7]，然而从最适宜肉品质日粮水平出发对乌金猪脂肪组织脂类分解代谢相关基因表达的影响尚缺乏深入研究。

脂肪组织中脂肪的分解及脂肪酸的转运和氧化对脂肪沉积的影响非常重要。激素敏感脂酶(HSL)是一种在脂肪动员中起重要作用的酶类，是脂肪分解的限速酶，能水解甘油三酯成甘油和脂肪酸以满足动物体的需要，它一直被认为是调节动物体脂肪分解的关键酶。脂蛋白脂酶(LPL)是脂质代谢中的关键酶，它的主要功能是水解极低密度脂蛋白和乳糜微粒中的甘油三酯，使之转变成相对分子质量较小的脂肪酸，以供各种组织贮存和利用。肉碱脂酰转移酶1(CPT-1)位于线粒体外膜，它使长链脂肪酸和肉碱发生酯化，以此将长链脂肪酸转运进入线粒体，是脂酰辅酶A转入线粒体进行脂肪酸β-氧化的限速酶。本研究表明，与NRC日粮组结果比较可知，WJ日粮组促进乌金猪肌肉组织中HSL、LPL和CPT-1基因mRNA相对表达量，与脂肪酸分解代谢相关基因表达受到上调，脂肪组织脂肪动员增强，极低密度脂蛋白和乳糜微粒中的甘油三酯水解为脂肪酸增加，并且脂肪酸β-氧化作用增强，这说明脂肪组织中脂解作用增强，脂肪组织产生的脂肪酸增加，进入线粒体进行β-氧化的脂肪酸增加，脂肪组织的脂肪酸分解作用增强。

在调解脂肪储存与释放，维持机体能量平衡以及脂肪细胞分化等方面，过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)具有重要作用，它是一类由配体激活的核转录因子，属于细胞核受体超家族的成员。本研究表明，相对于NRC日粮，WJ日粮显著促进了乌金猪脂肪组织中PPARγ基因mRNA的表达，脂肪氧化基因表达受到上调，说明脂肪氧化加强。

4 结 论

WJ日粮通过上调脂肪分解代谢相关基因的表达促进了脂肪组织脂肪的分解，减少了脂肪沉积。

参考文献：

[1] 王忠庆，荣耀先. 大河乌猪与大河猪(乌金猪)肉质形状研究[J]. 云南农业科技，2004，(S): 41-44.

[2] Zhang X, Zhao S M, Ge C R, et al. Effects of dietary digestible energy levels on meat quality in Wujin pig[J].Chinese Journal of Animal Nutrition，2008，20(4):338-377.

[3] Zhang X, Zhao S M, Ge C R, et al. Effects of dietary energy levels on growth performance and carcass composition of Wujin pigs[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2008, 20(5): 450-489.

[4] Zhao S M, Wang J, Song X L, et al. Impact of dietary protein on lipid metabolism-related gene expression in porcine adipose tissue[J].Nutrition & Metabolism,2010, 7(6):6-18.

[5] 葛长荣，赵素梅，张 曦，等. 不同日粮蛋白质水平对乌金猪肉品质的影响[J]. 畜牧兽医学报，2008，39(12):1 692-1 700.

[6] 潘洪彬，赵素梅，黄 英，等. 饲粮能量水平对乌金猪脂肪组织脂类合成代谢相关基因表达的影响[J].动物营养学报，2011,23(5)：781-788.

[7] 潘洪彬，王 静，黄 英，等. 饲粮能量水平对乌金猪脂肪组织脂类分解代谢相关基因表达的影响[J]. 动物营养学报，2011,23(11)：1 946-1 952.