邢咏梅，李红莲，郭顺星

活性氧（ROS）存在于所有真核生物正常细胞代谢过程中，现已明确低浓度非致死性的活性氧可以作为细胞-信号通路的调节分子，调节各种生理过程[1]。作为真核细胞型微生物的真菌，其分化发育也与活性氧的产生密切相关。Egan 等[2]通过研究证实，真菌细胞中的活性氧与细胞的分化直接相关。植物病原真菌由菌丝形成菌核的机制一直倍受研究者们的关注。Georgiou[3]首先提出了真菌菌核的形成及分化与氧化应激高度相关，并且发现了Sclerotium rolfsii 菌核的形成过程伴随着高度的脂质过氧化反应的发生。在随后的研究中，植物病原真菌菌核的形成被认为是由氧化应激触发形成的[4]。生物体内产生的活性氧包括：过氧化氢（H2O2）、单线态氧（）、羟自由基（·OH）、超氧自由基（·）等。药用真菌猪苓菌丝形成菌核过程中是否伴随 ROS 的变化以及抗氧化剂对猪苓菌丝形成菌核的影响值得探讨。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验菌株 本实验所用猪苓采自山西古县北平镇党家山村，由中国医学科学院药用植物研究所郭顺星研究员分离鉴定，保存于麦麸琼脂培养基中。

1.1.2 试剂 麦芽糖、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、维生素 B1、琼脂粉等购自北京科百奥生物科技有限公司。

1.1.3 主要仪器 SP-752 紫外可见光分光光度计购自上海光谱仪器有限公司；除菌滤器、微孔滤膜（孔径 0.22 μm，直径 13 mm）购自北京科百奥生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 麦芽糖琼脂培养基的配制 培养基由麦芽糖 20.0 g、K2HPO41.0 g、KH2PO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、琼脂粉 15.0 g、去离子水1000 ml 配制而成。培养基在高压灭菌前，将初始pH 调至 5.0。

1.2.2 抗氧化剂的添加 将维生素 C（Vc）溶解于去离子水中，配制成 100 mg/ml 的母液，母液经0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌后，将不同体积的 Vc母液分别加入到灭菌后冷却至 60 ℃ 左右的麦芽糖琼脂培养基中，使 Vc 在培养基中的终浓度分别为 0.5、1.0、2.0、5.0、10 和 15 mg/ml。将 NADPH氧化酶抑制剂 apocynin（Apo）溶解于去离子水中并以超声助溶，配制成 100 mmol/L 的母液，加入至灭菌后冷却至 60 ℃ 左右的麦芽糖琼脂培养基中，使其在培养基中的终浓度分别为 10、20、40 mmol/L。每组 30 个重复，实验重复 3 次。以不添加抗氧化剂的组为对照组，将培养基倒入直径为 9 cm 的平皿中，每个平皿倒入 20 ml 培养基。

1.2.3 培养及接种方法 参照文献[5-6]中培养猪苓的方法进行。

1.2.4 观察猪苓菌丝生长及菌核形成情况 观察猪苓菌丝在培养过程中的生长情况。培养 60 d，用镊子和手术刀片将猪苓菌核取出并称取猪苓菌核鲜重，以不添加抗氧化剂的组为对照组，比较各组猪苓菌核形成的生物量情况。

1.2.5 NBT 还原法检测猪苓菌核形成过程中菌丝及菌核活性氧含量 以不添加 Vc 的组为对照组，考察猪苓菌丝形成菌核过程中菌丝及菌核的活性氧含量以及抗氧化剂 Vc 对猪苓菌核发育过程中活性氧含量的影响。按照文献[7]中方法进行测定，将不同发育阶段的猪苓菌丝或菌核样本（0.1 g）与 1 ml 磷酸缓冲液（0.05 mol/L，pH 7.8）充分混合后研磨匀浆（磷酸缓冲液中含有溶质 0.1 mmol/L EDTA，0.3% w/v Triton X-100 及 4% w/v PVP聚乙烯吡咯烷酮），4 ℃ 条件下，15000×g 离心20 min 后取上清液 1 ml，加入 2 ml 0.05% 氯化硝基四氮唑蓝（NBT）与上清液反应 10 min，4 ℃，15000×g，离心 20 min 后取上清液。在 85 ℃ 水浴中孵育 5 min，冷却至室温，于波长 580 nm 处测定吸光度，吸光度的值与活性氧的含量成正比。每个样品重复 3 次。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 抗氧化剂对猪苓菌丝生长和菌核形成的影响

不同浓度 Vc 和 Apo 对猪苓菌核生物量的影响结果见表 1。培养 60 d，低浓度（0.5 mg/ml）的Vc 组（Vc-0.5）能够促进猪苓菌丝生长并促使猪苓菌丝形成菌核，猪苓菌丝生长旺盛，气生菌丝发达（图 1B），其菌核形成的生物量为不添加 Vc 的对照组的 1.09 倍，两者之间的差异无显著性（P ＞0.05）。浓度为 1.0 mg/ml 的 Vc 组(Vc-1)猪苓菌丝生长旺盛，其菌核形成的生物量仅为对照组的57%（图 1C）；浓度为 2.0 mg/ml的 Vc 组（Vc-2）猪苓菌丝其菌核形成的生物量仅为对照组的 29%；浓度为 5.0、10、15 mg/ml Vc 组（Vc-5、Vc-10、Vc-15）对猪苓菌丝生长具有不同程度的抑制作用，随着 Vc 浓度的升高，其对猪苓菌丝生长抑制程度增强，Vc-5 组猪苓菌丝生长较缓慢，气生菌丝不发达，外围新生菌丝与接种处周围生长的菌丝之间有明显的空隙（图 1D）；Vc-15 组中的猪苓菌丝呈固缩状生长，气生菌丝不发达（图 1F）；Vc-5、Vc-10、Vc-15 组均不能使猪苓菌丝形成菌核。与不添加抗氧化剂的对照组相比，NADPH 氧化酶抑制剂 Apo（10、20、40 mmol/L）使猪苓菌丝生长明显减缓，并且不能诱导猪苓菌核形成。

表1 抗氧化剂对猪苓菌核形成的生物量的影响（）Table1 Effects of antioxidants on P.umbellatus sclerotia biomass ()

表1 抗氧化剂对猪苓菌核形成的生物量的影响（）Table1 Effects of antioxidants on P.umbellatus sclerotia biomass ()

注：*：P ＞ 0.05；**：P ＜ 0.05。Note: *: P ＞ 0.05; **: P ＜ 0.05.

组别（n = 30）Groups（n = 30）菌核生物量(g/20g 基质)Biomass of sclertia (g/20 g substrate)Vc-0（对照） Vc-0 (control) 1.55 ± 0.10 Vc-0.5 1.69 ± 0.06*Vc-1 0.88 ± 0.20**Vc-2 0.45 ± 0.08**Vc-5 0 Vc-10 0 Vc-15 0 Apo（10、20、40 mmol/L） 0

2.2 NBT 还原法检测猪苓菌核形成过程中活性氧含量

随着培养时间的延长，在培养的不同时相，以不添加 Vc 的 Vc-0 组猪苓菌丝内 ROS含量为最高，其次是 Vc-0.5 组，随着 Vc 浓度的升高，猪苓菌丝内 ROS 含量逐渐降低。各组从培养的 15 ～45 d，猪苓菌丝内 ROS 含量呈逐渐增高的趋势；当培养 45 d 时，猪苓菌丝内 ROS 含量达到最高，此时，Vc-0 组猪苓菌丝内 ROS 含量仅为 Vc-0.5组的 1.091 倍；Vc-0 组猪苓菌丝内 ROS 含量为Vc-1 组的 1.315 倍，为 Vc-2 组的 1.757 倍，为Vc-5 组猪苓菌丝内 ROS 含量的 2.76 倍，说明高浓度的 Vc 在很大程度上消除了活性氧，而添加了低浓度的 Vc 组（0.5 mg/ml）对活性氧的清除作用并不明显；随着培养时间的延长，猪苓菌丝内 ROS含量出现降低的趋势并逐渐保持平稳，结果见图 2。

图1 培养 60 d，抗氧化剂 Vc 对猪苓菌核形成的影响[A：未添加 Vc 的 Vc-0 组（对照组）；B：Vc-0.5 组；C：Vc-1 组；D：Vc-5 组；E：Vc-10 组；F：Vc-15 组]Figure1 Effect of antioxidants on P.umbellatus sclerotial formation after cultivation for 60 days (A: Control group without Vc; B:Vc-0.5 group with 0.5 mg/ml vitamin C; C: Vc-1 group with 1 mg/ml vitamin C; D: Vc-5 group with 5 mg/ml vitamin C; E: Vc-10 group with 10 mg/ml vitamin C; F: Vc-15 group with 15 mg/ml vitamin C)

图2 抗氧化剂 Vc 对猪苓菌丝形成菌核过程中活性氧含量的影响Figure2 Effects of antioxidants on ROS content during sclerotial formation directly from mycelia

3 讨论

研究发现，植物病原菌 S.rolfsii 菌核形成和分化过程中伴随着高水平的氧化应激[3]；抗氧化剂的应用能够抑制 S.rolfsii、Rhizoctonia solani、Sclerotinia minor 以及 Sclerotinia sclerotiorum 菌核的形成和分化[8-9]。生物体内活性氧的产生与抗氧化防御功能之间的平衡发生紊乱造成了氧化应激状态的形成[10]。

本研究发现，低浓度的 Vc（0.5 mg/ml）能够促进猪苓菌丝生长并促使猪苓菌丝形成菌核；虽然低浓度的 Vc 能够部分的抵消猪苓菌丝及菌核活性氧的含量，但与不添加 Vc 的对照组相比，两组中的猪苓菌丝的活性氧含量十分接近，说明两组中菌丝内的氧化应激水平接近，因此，对猪苓菌核形成的生物量无显著性差异。随着 Vc 浓度的增加，猪苓菌丝内活性氧的含量逐渐下降，当 Vc 浓度为5.0、10、15 mg/ml 时，猪苓菌丝不能形成菌核，可能与猪苓菌丝内的活性氧的含量过低，导致菌丝内的氧化应激水平过低有关。因此，猪苓菌丝形成菌核过程中伴随活性氧的迸发，猪苓菌丝内氧化应激达到一定的水平时才可能促使猪苓菌丝向菌核分化。然而，猪苓菌丝形成菌核的过程是一个复杂的多因素综合作用的结果，各种理化因子及生物调控因子共同参与其中，有关猪苓菌丝形成菌核的分子生物学机制的研究正在进一步的探讨中。我们期待在以后的研究中有新的发现，为深入探讨猪苓菌丝形成菌核机制的研究提供重要的理论基础。

[1] Zhang LY.The role of reactive oxygen species in plant signal transduction.Pioneering Sci Technol Month, 2005, 18(6):144-145.(in Chinese)张玲艳.活性氧在植物信号转导中的作用.科技创业月刊, 2005,18(6):144-145.

[2] Egan MJ, Wang ZY, Jones MA, et al.Generation of reactive oxygen species by fungal NADPH oxidases is required for rice blast disease.Proc Natl Acad Sci U S A, 2007, 104 (10):11772-11777.

[3] Georgiou CD.Lipid peroxidation in Sclerotium rolfsii: a new look into the mechanism of sclerotial biogenesis in fungi.Mycological Res,1997, 101(4):460-464.

[4] Georgiou CD, Zervoudakis G, Petropoulou KP.Ascorbic acid might play a role in the sclerotial differentiation of Sclerotium rolfsii.Mycologia, 2003, 95(2):308-316.

[5] Xing YM, Guo SX.Effects of environmental factors on development of mycelia growth of Polyporus umbellatus.Chin Pharm J, 2011,46(7):493-496.(in Chinese)邢咏梅, 郭顺星.环境因子对猪苓菌丝体生长发育的影响.中国药学杂志, 2011, 46(7):493-496.

[6] Xing YM, Chen J, Lv YL, et al.Dertermination of optimal carbon source and pH value for sclerotial formation of Polyporus umbellatus under artificial conditions.Mycol Prog, 2011, 10(1):121-125.

[7] Keppler LD, Baker CJ.O2--initiated lipid peroxidation in a bacteria-induced hypersensitive reaction in tobacco cell suspentious.Phytopathology, 1989, 79(5):555-562.

[8] Georgiou CD, Tairis N, Sotiropoulou A.Hydroxyl radical scavengers inhibit lateral-type sclerotial differentiation and growth in phytopathogenic fungi.Mycologia, 2000, 92(5):825-834.

[9] Georgiou CD, Tairis N, Sotiropoulou A.Hydroxyl radical scavengers inhibit sclerotial differentiation and growth in Sclerotinia sclerotiorum and Rhizoctonia solani.Mycological Research, 2000, 104(10):1191-1196.

[10] Xie QK, Liu XC.Effects of calcium dobesilate on oxidative stress in type 2 Diabetes mellitus.China Pharm, 2004, 15(12):721-723.(in Chinese)谢泉琨, 刘晓城.羟苯磺酸钙对2型糖尿病模型大鼠肾脏氧化应激的影响.中国药房, 2004, 15(12):721-723.