张亚丽 李 伶 杨刚毅 卢春敏

(重庆医科大学检验系临床生化教研室 教育部临床检验诊断学重点实验室，重庆 400016)

Visfatin是2004年新发现的脂肪细胞因子，由内脏脂肪分泌而得名，与此前发现的前B细胞克隆增强因子(PBEF)，烟酰胺磷酸核糖基转移酶(Nampt)都是同一种物质;研究发现Visfatin能够结合并调节胰岛素受体，具有胰岛素样作用，可以降低小鼠血浆葡萄糖水平，但其作用位点又不同于胰岛素〔1〕。为了全面评估Visfatin在脂代谢中所起的作用，本研究运用RNA干扰技术，通过构建Visfatin-shRNA表达载体特异性地抑制细胞内Visfatin基因表达，建立了Visfatin基因缺陷细胞模型，观察了这种情况下细胞内脂代谢相关基因的表达变化并分析其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 小鼠前脂肪细胞3T3-L1(中国医学科学院上海细胞库);Hepa1-6细胞(中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心);OPTI-MEM、DMEM培养基、胎牛血清(美国 Gibco公司);小牛血清(杭州四季青公司);LipofectamineTM2000、PCR引物(美国 Invitrogen公司);RNA提取试剂和SYBR@Premix Ex TaqTMⅡRT-PCR试剂盒、限制性内切酶、寡核苷酸片段等(Takara公司);质粒小抽试剂盒、胶回收试剂盒(美国O-mega公司);质粒大抽试剂盒(去内毒素)(北京天根生化科技公司);大肠杆菌 DH5α(本课题组保存);pGenesil-1.2质粒和pGenesil-HK质粒(武汉晶赛生物工程技术有限公司);油红O(美国Sigma公司);兔抗小鼠β-actin一抗、HRP标记的羊抗兔IgG二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司);兔抗小鼠Visfatin一抗(Abcam公司);荧光定量PCR仪(美国Bio-rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及诱导分化 将313-L1前脂肪细胞接种于6孔板，待细胞生长融合2 d后先以3-异丁基-1-甲基黄嘌呤+地塞米松+胰岛素诱导2 d，再单独以胰岛素诱导2 d后，10%胎牛血清的DMEM培养基维持培养2 d，大部分细胞分化为成熟脂肪细胞，即可用于实验。3T3-L1细胞培养及传代：37℃，5%CO2条件下，使用含10%小牛血清的 DMEM培养基(含双抗)培养细胞，当细胞生长至70%左右即可进行细胞传代。Hepa1-6细胞培养及传代：37℃，5%CO2，DMEM+10%FBS+100 IU双抗进行常规细胞培养，当细胞铺满培养瓶底90%左右时即可传代。

1.2.2 pGenesil-visfatin重组质粒的构建与筛选 根据shRNA设计原则，设计并合成6条寡核苷酸片段，将合成的片段分别退火连接并稀释，pGenesil-1.2质粒经Eco311酶切线性化后与稀释片段连接，转化DH5α感受态细菌后挑单克隆质粒小抽，经酶切、测序鉴定正确后，用去内毒素的质粒大抽试剂盒抽提备用。鉴定正确的重组质粒分别命名为：pGenesil-visfatin1，2，3。选择易于培养的Hepa1-6细胞进行筛选，分别对转染48，72，96 h后shRNA对Visfatin基因的抑制效果进行比较，选取抑制效果最佳的重组质粒，命名为pGenesil-Visfatin，然后在诱导分化成熟的脂肪细胞中验证shRNA的有效性。

1.2.3 细胞分组及转染 将诱导分化成熟的313-L1脂肪细胞和Hepa1-6细胞分别分为3组，即空白对照组(无质粒组)，阴性对照组(转染 pGenesil-HK组)，干扰组(转染pGenesil-visfatin组)，每组设平行实验复孔(3孔)，将质粒和脂质体按1∶2.5的比例与Opti-MEM混合后进行转染，转染方法按LipofectamineTM2000说明书。

1.2.4 Visfatin蛋白表达检测 采用Western印迹法检测各组细胞Visfatin蛋白表达水平。提取各组细胞总蛋白，按每泳道加80 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳，湿转至PVDF膜，室温封闭3 h，一抗(内参 β-actin 1∶100，Visfatin 1∶250 稀释)4℃孵育过夜，二抗(1∶2 000稀释)37℃孵育l h并洗脱，将PVDF膜置于化学发光板，加入发光试剂，室温反应2 min后置化学发光成像系统成像。

1.2.5 Visfatin、脂代谢相关基因mRNA表达水平检测 转染48 h后，收集各组细胞总RNA，逆转录合成cDNA。采用SYBR Green l荧光染料实时定量PCR法检测Visfatin以及脂代谢相关基因：过氧化物酶增殖物激活受体 α/γ(PPARα/γ)、激素敏感性脂肪酶(HSL)、脂肪组织甘油水解酶(ATGL)、脂肪酸结合蛋白(AP2)、固醇调节元件结合蛋白 1/2(SREBP1/2)、脂肪酸合成酶(FAS)、乙酰辅酶 A羧化酶(ACC)、β羟-β甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGCR)、低密度脂蛋白受体(LDLr)、甘油三酯(TG)mRNA的表达。以β-actin为内参，用2－△△Ct值表示目的基因的相对表达量。所用引物序列略。

1.2.6 脂质积聚实验 采用油红O染色比色法检测各组3T3-L1细胞内脂质积聚变化，即先吸去各孔内培养基，用PBS轻洗细胞3次，每孔加入适量10%中性甲醛固定1 h，PBS轻洗3次，晾干，加入新鲜配制的油红O工作液染色30 min，去离子水洗3次，待完全干燥后，加入1 ml异丙醇洗脱10 min，收集各孔洗脱液于490 nm比色，每孔测定3次，记录各组OD值。

2 结果

2.1 Visfatin-shRNA表达载体构建和鉴定 重组质粒pGenesil-Visfatin1，2，3经SacI酶切，均能切出一条约 625 bp的片段(图1)，证明shRNA片段已成功插入到载体pGenesil-1.2中。酶切小片段测序结果与所设计片段序列一致，说明插入片段碱基序列正确。表明 Visfatin-shRNA表达载体 pGenesil-Visfatin1，2，3 构建成功。

2.2 Visfatin-shRNA最佳抑制片段的筛选与验证 转染Hepa1-6细胞后，实时荧光定量PCR检测各组细胞Visfatin mRNA表达情况，以空白对照组 Visfatin mRNA表达量为1，pGenesil-Visfatin1，2，3对 Visfatin mRNA的抑制率分别为：44.9%，59.4%，71.9%(P均＜0.001)。并且pGenesil-Visfatin3转染后72 h的抑制效果最好，故将pGenesil-Visfatin3命名为 pGenesil-Visfatin，其寡核苷酸片段序列为 GCGCTTTGCTACAGAAGTTAA。将转染后72h作为检测时间，进一步在脂肪细胞中验证其有效性，shRNA转染组脂肪细胞Visfatin mRNA表达显著低于空白对照约70.5%(P＜0.001)，表明该质粒能有效抑制脂肪细胞中Visfatin基因表达。

2.3 Visfatin蛋白水平检测 shRNA转染组细胞Visfatin蛋白表达较空白对照组与阴性对照组均明显降低，从蛋白水平验证了Visfatin基因抑制细胞模型构建成功。见图2。

2.4 Visfatin基因表达抑制对细胞脂代谢相关基因的影响在脂肪细胞，转染pGenesil-Visfatin组与空白对照组相比，脂质合成相关基因 SREBP1，FAS，ACC表达分别降低 17.7%，51.1%和 10.5%，差异均有统计学意义。转录调节因子PPARα，PPARγ分别降低 40.5%，11.1%;脂质分解相关基因HSL，ATGL，AP2分别降低约 44.5%，23.2%，52.1%，均有统计学意义。在Hepa1-6细胞，脂质合成相关基因SREBP1降低50.3%，FAS降低32.2%(二者 P＜0.001)，ACC降低 12.9%(P＞0.05);转录调节因子 PPARαmRNA降低 22.6%(P＜0.001)，脂质分解相关基因HSL及 ATGL mRNA水平变化则不具有统计学意义;胆固醇代谢相关基因SREBP2，HMGCR，LDLr分别降低22.1%，26.3%，51.0%(P＜0.001)。

图1 pGenesil-Visfatin1，2，3重组质粒的酶切鉴定

2.5 Visfatin基因表达抑制对脂肪细胞内TG含量的影响 油红O染色法对脂肪细胞内TG含量在Visfatin基因表达抑制前后的变化进行半定量分析，通过比较发现，Visfatin基因干扰组脂肪细胞内 TG含量较空白对照组有轻微降低(0.862±0.016 vs0.878±0.024)，但不具有统计学意义。

图2 脂肪细胞Visfatin蛋白电泳图和Hepa1-6细胞Visfatin蛋白电泳图

3 讨论

PPARs是一种配体激活转录因子，在调节细胞分化和能量平衡中发挥重要作用〔2〕。PPARs 包括 PPARα、PPARβ/δ、PPARγ三种亚型。PPARα主要表达于脂肪酸分解代谢旺盛的组织，能刺激脂肪酸摄取和活化、脂肪酸氧化等〔3〕;PPARγ主要存在于脂肪组织，是细胞分化和脂质积累所必需的调节因子〔4〕;PPARβ/δ分布广泛，本研究未对其进行检测。本课题组前期研究发现Visfatin过表达可增加大鼠脂肪组织PPARγ mRNA表达〔5〕，本研究表明 Visfatin基因表达下调导致了这两个转录调节因子表达的降低，这将进一步影响其对靶基因的转录调节，并对脂代谢产生影响。HSL和ATGL是脂肪分解的限速酶，二者都是PPARα的靶基因，AP2是高表达于脂肪细胞的一种蛋白，它与 HSL结合并增加其脂解活性〔6〕。在脂肪细胞Visfatin基因抑制组，HSL、ATGL、AP2 mRNA表达也明显降低，表明Visfatin对脂解相关基因具有调节作用，这种作用可能是通过改变其上游转录调节因子PPARα基因表达来实现的。在肝细胞中HSL与ATGL的变化不具统计学差异，其原因可能是肝细胞中PPARα受Visfatin基因表达的影响较脂肪细胞中小。因此我们认为Visfatin基因表达下调对脂肪分解产生了一定的影响。

SREBPs是调节脂肪酸和胆固醇代谢的关键核转录因子，有3种形式SREBP-la、SREBP-1c和 SREBP-2。SREBP-1c主要调控脂肪酸生物合成通路的基因表达;SREBP2则主要调节胆固醇摄取和合成相关的基因表达〔7〕。本研究可观察到在Visfatin基因抑制组，SREBP1c，SREBP2 mRNA表达较对照组都有明显降低。FAS和ACC是调节脂肪酸内源性合成的酶类，二者都是脂肪酸合成的关键酶〔8〕。FAS在新生脂质合成中处于中心地位，其活性改变主要是因为基因本身的转录发生改变〔9〕;ACC则催化丙二酰CoA的合成反应，丙二酰CoA是 FAS发挥作用以及脂肪链延伸不可缺少的底物〔10〕。本研究中，FAS和ACC mRNA表达在Visfatin基因干扰组都有明显下降，可能与SREBP1基因表达下降有关，因为二者都是SREBP1调控的靶基因〔7〕。因此，Visfatin基因表达下调可能会使脂肪酸合成反应受到抑制。

对脂肪细胞进行油红O染色显示，Visfatin基因抑制组TG含量较对照组轻微降低，但不具有统计学意义，其原因可能是Visfatin基因的改变导致主导TG代谢上游的某个(或几个)基因产生变化，从而使整个TG代谢受到一定的影响，其具体作用机制有待进一步的深入研究。微粒体酶HMGCR是胆固醇合成的限速酶，而胆固醇摄取主要是通过LDLr途径完成的。研究发现在大鼠体内过表达 Visfatin可导致 SREBP2，HMGCR mRNA表达明显升高〔5〕。本研究表明肝细胞合成胆固醇及通过LDLr途径摄取胆固醇的能力降低，可能是由于通过抑制SREBP2的表达，使其激活下游靶基因的能力降低，最终导致细胞对胆固醇的代谢降低;或者是因为使细胞内胆固醇含量增加，而胆固醇对HMGCR及LDLr都具有负反馈调节作用，所以导致两种基因表达的下调。

综上所述，通过本研究，我们认为Visfatin基因抑制可能通过改变主导TG代谢上游的某个(或几个)基因产生变化，从而使整个TG代谢受到的影响，同时能调节胆固醇代谢，其对活体内脂代谢的影响及作用机制尚需进一步的研究。

1 Fukuhara A，Matsuda M，Nishizawa M，et al.Visfatin：a protein secreted by visceral fat that mimics the effects of insulin〔J〕.Science，2005;307(5708)：426-30.

2 Evans RM，Barish GD，Wang YX.PPARs and the complex journey to obesity〔J〕.Nat Med，2004;10(4)：355-61.

3 Rakhshandehroo M，Sanderson LM，Matilainen M，et al.Comprehensive analysis of PPARα-dependent regulation of hepatic lipid metabolism by expression profiling〔J〕.PPAR Res，2007;2007：26839.

4 Barak Y，Nelson MC，Ong ES，et al.PPAR gamma is required for placental，cardiac，and adipose tissue development〔J〕.Mol Cell，1999;4(4)：585-95.

5 李仁哲，孙 勤，杨刚毅，等.内脂素基因过表达对大鼠胰岛素敏感性和血浆FGF-21水平的影响〔J〕.中华内分泌代谢杂志，2008;24(5)：542-5.

6 Shen WJ，Sridhar K，Bernlohr DA，et al.Interaction of rat hormone-sensitive lipase with adipocyte lipid-binding protein〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1999;96(10)：5528-32.

7 Guillou H，Martin PG，Pineau T.Transcriptional regulation of hepatic fatty acid metabolism〔J〕.Subcell Biochem，2008;49：3-47.

8 Loftus TM，Jaworsky DE，Frehywot GL，et al.Reduced food intake and body weight in mice treated with fatty acid synthase inhibitors〔J〕.Science，2000;288(5475)：2379-81.

9 Claycombe KJ，Jones BH，Standridge MK，et al.Insulin increases fatty acid synthase gene transcription in human adipocytes〔J〕.Am J Physiol，1998;274(5pt2)：R1253-9.

10 Wang Y，Jones Voy B，Urs S，et al.The human fatty acid synthase gene and de novo lipogenesis are coordinately regulated in human adipose tissue〔J〕.J Nutr，2004;134(5)：1032-8.