顾向飞, 边平江, 周小龙, 林志华, 董迎辉

(1. 宁波大学 海洋学院, 浙江 宁波 315211; 2. 浙江万里学院 浙江省水产种质资源有效利用技术研究重点实验室, 浙江 宁波 315100; 3. 浙江省海洋水产养殖研究所, 浙江 温州 325005)

栉江珧(Atrina pectinata), 又名江珧蛤、牛角江珧蛤、牛角蚶等, 隶属于软体动物门(Mollusca)瓣鳃纲(Lamellibranchia)贻贝目(Mytiloida)江珧科(Pinnidae)江珧属(Atrina)[1]。栉江珧广泛分布于温、热带泥砂质的近海区域, 属于广温、广盐性的海产经济贝类, 主要分布于我国的福建、广东等沿海省份,在北方的山东、辽宁等海区也有分布[2]。栉江珧具有较高的食用价值, 是一种极具发展潜力的海水养殖种类。

近年来, 关于栉江珧人工繁育和繁殖生物学方面的研究已见诸报道, 如开展了亲贝人工促熟、稚贝附着基的选择[3-4]以及雌核发育单倍体诱导[5]等人工繁育研究, 进行了生殖细胞发生的研究[6-7]、受精过程的细胞学观察[8]、精子超低温冷冻保存以及精子线粒体荧光活性检查[9-10]等繁殖生物学研究。但是, 尚未见到关于栉江珧精子超微结构的研究报道。本研究利用透射电镜技术对栉江珧精子的超微结构进行了观察, 旨在为物种鉴定、生殖进化及受精机理研究提供细胞学依据。

1 材料方法

1.1 实验材料

栉江珧于2012年4月取自广东湛江东海岛自然海区, 贝龄2～3 a, 壳长20～25 cm, 于宁波甬盛水产种业有限公司暂养。暂养期间混合喂养微绿球藻(Nannochloropsis oculata)、亚心形扁藻(Platymonas subcordiformis)、牟氏角毛藻(Chaetoceros miielleri),以促进性腺发育。

1.2 精巢取样及透射电镜观察

栉江珧暂养2周后, 随机抽取雄性个体, 活体解剖取精巢, 切成小块, 用4℃ 2.5%戊二醛和1%锇酸双固定, 4℃冷藏保存。固定样品经0.1 mol/dm3磷酸缓冲液漂洗, 30%～90%梯度乙醇脱水, 90%丙酮置换,无水丙酮脱水, Epon 812环氧树脂包埋, 在日立H-7650透射电镜下对精巢样品切片进行观察并拍照。

2 栉江珧精子超微结构电镜观察结果

栉江珧精子形态为近圆形, 属于鞭毛型。成熟的精子由头部、中段和尾部3部分构成。头部长度约3 μm, 包括顶体(acrosome)和细胞核(nucleus)(图1a)。中段则由中心粒复合体(centriolar complex)和线粒体(mitochondria)构成。尾部为鞭毛型。

图1 栉江珧精子的超微结构Fig. 1 Ultrastructure of spermatozoon in Atrina pectinata

2.1 顶体

顶体位于精子头部最前端, 在透射电镜下可观察到顶体明显突出。顶体纵切面呈倒“V”形, 在精子纵切面中轴方向上, 顶体长度约 0.7 μm, 占精子头部长度的 1/5。顶体物质外包被一层膜, 根据其位置可分为顶体内膜(inner acrosomal membrane)和顶体外膜(outer acrosomal membrane), 二者围成顶体腔(acrosomal space)(图1b), 腔内顶体物质分布不均匀,靠近顶体外膜的为电子密度较大的弧状带。顶体外膜与质膜之间存在一薄层胞质, 顶体内膜与细胞核形成亚顶体腔(subacrosomal space)(图1b、图1c), 腔内亚顶体物质电子密度均匀且较低。

2.2 细胞核

顶体后部紧接着细胞核, 细胞核呈近球形, 直径约 2.0 μm, 长度约 1.7 μm, 占精子头部体积的大部分(图1d)。细胞核是一个电子致密区域, 内含有高度浓缩的染色质, 同时可观察到不规则染色较浅的核泡(nuclear vacuole)存在(图1a)。细胞核前端略凹陷, 形成核前窝; 无核后窝; 在后端与线粒体相邻处, 细胞核向内凹陷形成植入窝(implantation fossa)(图1e、图1f), 线粒体嵌于植入窝内。

2.3 中段

中段位于头部和鞭毛之间, 由中央的中心粒复合体和呈辐射状排列的线粒体构成。中心粒复合体由近端中心粒(proximal centriole)和远端中心粒(distal centriole)构成(图1e), 两个中心粒均为圆柱状,由9组微管组成。远端中心粒是鞭毛的基体, 在末端发出鞭毛, 其长轴与精子的长轴方向一致, 近端中心粒则与远端中心粒互相垂直。中段横切面可以观察到5个线粒体(图1f)。线粒体嵌入细胞核的植入窝,为近椭圆形或球形, 长轴约0.3 μm, 短轴约0.2 μm。线粒体电子密度均匀且较低, 由内外两层膜组成,内膜向腔内折叠形成线粒体嵴。

2.4 尾部

精子的尾部为鞭毛型, 横切面呈圆形, 直径约0.25 μm, 内部为轴丝(axoneme), 外部包被的质膜(plasma membrane)呈波浪状(图1g、图1h)。轴丝由远端中心粒末端发出, 起始端无中央微管, 为外周的9组二联微管结构, 起始端之后为典型的“9+2”型结构。

3 讨论

顶体是位于细胞核与质膜之间的囊状细胞器,是一种特化的溶酶体, 含有多种水解酶类, 如透明质酸酶、酸性磷酸酶、蛋白水解酶等, 能够溶解卵细胞的外被及滤泡细胞, 产生孔道, 使精子进入卵细胞[11]。 顶体酶作为受精过程中的关键酶, 在精子穿透卵膜时起溶解卵膜的作用, 对于营体外受精的贝类是十分重要的, 因而顶体酶活性高低可直接影响受精[12]。而对于褶纹冠蚌(Cristaria plicata)[13]、三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)[14]等受精过程发生在雌贝外鳃腔内的淡水蚌类而言, 受精环境相对稳定的, 并且卵的胶质卵膜较薄, 精子无需发达的顶体就可入卵, 因此这些贝类精子顶体通常体积较小, 结构简单[15]。顶体腔内电子密度反映腔内的物质组成, 帘文蛤(Meretrix lyrata)[15]、西施舌(Coelomactra antiquata)[16]、沟纹巴非蛤(Paphia exarata)[17]等基部靠近核的位置电子密度较高; 而栉江珧与文蛤(Meretrixmeretrix)[18]、 彩虹明 櫻 蛤(Moerella iridescens)[19]、翡翠贻贝(Perna viridis)[20]、合浦珠母贝(Pinctada martensi)[21]等类似, 靠近顶体外膜内侧的位置电子密度较高, 推测腔内电子密度反映腔内顶体酶的分布。栉江珧精子顶体结构为明显的倒“V”字形, 且顶体约占整个头部的 1/3, 顶体腔及亚顶体腔内含有电子密度不同的酶, 这与其生存的海水环境及体外受精机制是相适应的。

贝类精子结构在不同种属间存在差异, 对于贝类系统分类具有重要意义[22]。多数双壳贝类精子的细胞核为卵圆形, 如沟纹巴非蛤[23]、墨西哥湾扇贝(Argopecten irradians concentricus)[24]; 少数贝类精子的细胞核为圆柱形, 如栉孔扇贝(Chlamys farreri)[25]、虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)[26]等: 还有一些贝类精子的细胞核近圆锥形, 如菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)[27]、斧文蛤(Meretrix lamarkii)[28]等; 但也存在特殊形态的细胞核, 如彩虹明樱蛤的细胞核为螺旋状[19]。栉江珧精子的细胞核为近球形, 生物细胞的结构形状与功能是相统一的,精子细胞核的形状在一定程度上适应其在水中的运动以及穿透卵膜的能力, 从而提高受精的成功率。

核前窝是顶体丝突起的重要结构基础, 而核后窝是精子尾部鞭毛形成的结构基础; 核前窝的存在使得精子可以容纳更多的亚顶体腔物质, 增加受精成功率[29]。精子细胞核的核前窝的有无在科内较为接近但存在差异, 如蚶科的毛蚶(Scapharca subcrenata)[29]、泥蚶(Tegillarca granosa)[30]及魁蚶(Scapharca broughtonii)[31]的精子细胞核形状接近, 均为有核后窝而无核前窝, 但同科的青蚶(Barbatia virescens)[23]的细胞核则具有核前窝及核后窝。核前窝、核后窝的有无并不能作为判别物种间亲缘关系的依据, 仍需引入其他可度量指标[15]。栉江珧精子具有核前窝, 使得其精子具有较大的亚顶体腔, 以容纳一些亚顶体腔物质, 虽不具有核后窝, 但具有完整的中心粒复合体, 具有完整的尾部结构, 有助于其在海水中游动及穿透卵膜完成受精。

线粒体切面通常呈卵圆形, 是由内外两层彼此平行的单位膜套叠而形成的封闭的囊状结构, 内膜向内折叠形成嵴, 嵴上分布有大量的呼吸链酶系及ATP 酶复合体, 可为精子运动和入卵过程提供能量[11]。同种双壳贝类精子线粒体数目通常一致, 不同种类精子线粒体数目会有细微不同。通过比较双壳贝类精子超微结构, 发现绝大多数精子线粒体数目为 4～5 个, 偶见 6 个[18]; 而本研究通过观察精子中段横截面, 发现栉江珧具有5个线粒体, 没有发现4个或者6个的情况, 故可以推断栉江珧精子线粒体数目较为稳定。根据细胞代谢的需要, 线粒体在细胞质中可以进行运动、融合或者分裂增殖[11]。根据精子发生过程的研究可知, 线粒体的数目及位置在精细胞的早期就基本确定, 但在精子发生过程中存在着小个体线粒体融合成为个体较大线粒体的现象,据此双壳贝类中成熟精子线粒体数目不一致是因为线粒体融合出现偏差。

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