汤 健 , 管云雁, 刘文广, 何毛贤

(1. 中国科学院大学, 北京 100039; 2. 中国科学院 南海海洋研究所, 中国科学院热带海洋生物资源与生态重点实验室, 广东 广州 510301)

马氏珠母贝(Pinctada fucata), 又称合浦珠母贝,主要分布于太平洋西南部, 是世界上培育海水珍珠的主要种类。在中国主要分布于广东、广西、海南和台湾海峡南部一带, 是中国海水珍珠养殖的主要品种。我国自1965年成功开展其人工育苗以来, 经多年养殖的马氏珠母贝的性状已呈现明显退化现象,盲目引种杂交给马氏珠母贝种质带来不同程度的影响, 具体表现为遗传力减弱、抗逆性差、成活率下降、性状退化等严重问题[1]。因此对马氏珠母贝进行遗传改良, 培育出生长快、个体大、育珠性状好的品种,是当前珍珠养殖业的重要课题。利用DNA分子标记可显著促进海洋生物资源保护和遗传改良工作的实施, 为遗传育种提供理论依据和指导[2-4]。目前, 中国已有科技工作者采用多种遗传标记对不同的马氏珠母贝野生种群、养殖种群及育种群体进行了遗传多样性和遗传变异的研究, 如RAPD[5-6]、ISSR[7-8]、AFLP[9-10]、 SSR[11-12]等, 然而利用DNA分子标记进行家系遗传研究还很少见到报道[13]。通过家系选育获得新的品系或品种, 对于马氏珠母贝优良品种的培育具有重要的意义。

微卫星(microsatellite), 又称简单序列重复(SSR,simple sequence repeat), 是2～6个碱基串联重复序列,广泛分布于真核生物基因组中[14-15]。微卫星由于分布随机广泛(包括编码区和非编码区), 多态性高, 符合孟德尔遗传, 可区分纯合子和杂合子表现共显性,适于操作等特点, 是近年来迅速发展起来的第二代DNA多态分子标记之一[16-17], 现已被广泛应用于水产经济品种的种质鉴定、遗传育种等研究领域[18-20]。本研究利用6个微卫星位点对9个马氏珠母贝家系进行了遗传分析, 以期获得9个家系的遗传多样性水平、遗传结构及可能与生长的关系, 为马氏珠母贝的育种选配方案提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 样品采集与基因组DNA提取

用于本研究的马氏珠母贝Pinctada fucata家系构建于 2008年并养殖于深圳大鹏澳海区, 编号F1～F12, 其中F1、F8和F10因台风灾害丢失,家系构建方法见汤健等[21]。从每个家系随机取样48个个体,取其闭壳肌组织于95%酒精中保存待用。取50～100 mg闭壳肌组织, 纯水漂洗后使用北京天根公司提供的海洋动物组织基因组提取试剂盒(QIAGEN Marine Animals DNA Kit)提取基因组DNA。DNA样品用1%琼脂糖凝胶电泳、EB染色检测, 并测定 260 nm和280 nm处吸光度, 检测DNA的质量和计算浓度, 然后配成20 ng/μL的DNA溶液备用。

1.2 微卫星引物筛选及PCR扩增

引物来源于石耀华等[22-23]开发的微卫星标记,共选用 60对引物由生工生物(上海)有限公司合成,通过优化 PCR反应条件, 初步筛选出能够稳定扩增的引物17对, 选用其中多态性较好的6对引物。引物信息见表1。

PCR 扩增反应总体积为25μL, 其中包括DNA模板 2μL, 10×PCR buffer 2.5μL, dNTP 2μL(2.5μmol/L),上下游引物(10μmol/L)各 1μL, MgCl2(25 mmol/L)1.5～2.0μL, Taq DNA 聚合酶(上海生工)1U, 加 ddH2O补足体系。按各引物条件于BioRad PTC-200 PCR扩增仪上进行扩增。PCR反应条件为94 ℃预变性5 min,94 ℃ 30 s, 58.5～61 ℃ 退火 30 s, 72 ℃ 2 min, 35 个循环,72 ℃延伸 10 min。

1.3 扩增产物检测

取PCR扩增产物2μL用10%聚丙烯酰胺凝胶在180 V电压下电泳分离4～5 h, 电泳缓冲液为0.5×TBE。电泳完毕后, 使用0.1%硝酸银溶液染色,显色液(0.5%氢氧化钠, 0.4%甲醛, 0.02%硼砂)显影,扫描仪扫描凝胶成像以记录实验结果。

1.4 数据统计与分析

微卫星是共显性遗传, 位点可以直接从聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱上判读。统计每个位点的等位基因数量(A), 用Popgene1.32软件计算每个家系的有效等位基因数(Ne)、观察杂合度(Ho)、期望杂合度(He),Hardy-Weinberg平衡检测和Shannon多样性指数(I), 同时计算了家系间的遗传距离(D)和遗传分化指数(FST)。

2 结果与分析

2.1 微卫星位点多态性及家系间遗传结构分析

图1 引物在家系部分个体中的扩增结果Fig. 1a The PCR results of SSR primer amplified in some individuals of family

6个微卫星标记在9个马氏珠母贝家系中均能扩增获得稳定清晰的条带, 并在不同家系中表现出不同程度的多态性(图1)。9个家系的平均等位基因数(A)、平均有效等位基因数(Ne)、平均期望杂合度(He)、平均观察杂合度(Ho)以及Shannon多样性指数(I)见表2。6个多态位点共检测出17个等位基因, 每个位点的等位基因数(A)2～4, 其中位点HNUPM068检测出的等位基因最多(4个), 位点HNUPM001、HNUPM004的等位基因最少(2个), F3、F5、F7和F12的A最高(3.333),F2的A最少(2.833); 9个家系的有效等位基因数(Ne)为2.030～2.632, 平均观测杂合度(Ho)为0.4306～0.6354,平均期望杂合度(He)为0.4380～0.5962, Shannon多样性指数(I)为0.7539～1.003; F6的He最高, 为0.5962, F9最低, 为0.438; F6具有最高的I值(1.003), F9最低(0.7539)。

表2 6个SSR位点在9个马氏珠母贝家系中的统计总结Tab. 2 Statistics of 6 microsatellite loci among nine families of Pinctada fucata

Hardy-Weinberg平衡χ2检验发现, 6个多态位点中, F4有1个位点偏离平衡状态, F2、F5和F9各有2个位点偏离平衡状态, F3、F6、F7和F11各有3个位点偏离遗传平衡状态(P＜0.05)。Hardy-Weinberg平衡指数(d)为-0.1573～0.1496。在9个家系中, 4个家系(F3、F4、F5和F7)表现为杂合子过剩(d＞0), 其余家系(F2、F6、F9、F11和 F12)均表现为杂合子缺失(d＜0)。

2.2 家系间遗传分化比较

分析结果显示, 各位点上 9家系间遗传分化系数FST为 0.0375～0.2733, 均值为 0.0749。发现有 4个位点FST小于0.05, 剩下两个位点的FST大于种群间无遗传分化的标准(FST=0～0.05)[24]。根据 Nei[25]计算9个家系的遗传距离和遗传相似性指数(表3), 结果显示F7和F9遗传距离最近(0.0202), 遗传相似性指数最高(0.9800); F11和F12遗传距离最远(0.2776),相似性指数最低(0.7576)。

表3 9个马氏珠母贝家系间的遗传距离及相似性指数Tab. 3 Genetic distances and similarity index among nine families of Pinctada fucata

利用软件MEGA 3.0, 根据遗传距离采用NJ法进行聚类分析。结果如图2所示, 聚类树分为明显的两支。F7和F9首先聚类, 再分别与F11、F4聚类, 然后与F2、F3相聚; 另一支F6和F12相聚后与F5相聚, 最后两支聚到一起。

图2 9个马氏珠母贝家系的NJ系统树Fig.2 NJ tree of nine families of Pinctada fucata

3 讨论

3.1 马氏珠母贝家系多样性水平及遗传差异分析

本研究中9个马氏珠母贝家系的观测杂合度为0.4306～0.6354, 期望杂合度为0.4380～0.5964, 所选6个位点的杂合度皆高于这些标记所分析的两个地理种群[26]。根据已有的文献报道[12-13,27-28], 微卫星标记分析的马氏珠母贝养殖群体的观测杂合度和期望杂合度分别为0.15～0.56和0.38～0.75, 与之相比, 本研究中的9个家系的观测杂合度处于中等偏上的水平, 期望杂合度处于中等水平。9个家系中, 其中有5个家系(F2、F6、F9、F11和F12)表现为杂合子缺失, 说明近交机会增大使得这些家系遗传多样性正在逐渐变小,进而造成纯合子增多、杂合子减少, 部分等位基因丧失。F4是一个自交家系, 其有效等位基因数最少,Ne和No也较低, 说明自交会使其遗传多样性降低。张红玉等[13]使用SRAP分子标记分析也表明马氏珠母贝家系的遗传多样性随世代的增加而有下降的趋势, 在罗非鱼、中国对虾的群体选育中也有相似的现象[29-30],连续的封闭群体自交会引起遗传多样性的下降。虽然一些研究表明杂交能提高后代的杂合度[31], 但由于本研究中其他3个自交家系丢失, 家系间杂交能否增加杂合度, 从而改善生长性能难以得到证实。

卡方检验Hardy-Weinberg平衡结果表明所检测的6个位点的基因型在群体中的分布均极显著偏离了Hardy-Weinberg平衡, 说明群体内的基因型频率发生了很大改变, 这与突变、杂交、选择等因素有关,与家系培育中亲本数量少也有很大的关系, 有限的亲本数量会引起养殖群体的遗传结构发生改变, 导致群体的随机漂变或瓶颈效应[32-33]。遗传分化的本质是基因频率的变化和杂合度变化, 是杂合度与一致度的度量。遗传分化系数FST能够反映各个家系间的分化水平, 本研究中各座位的FST均值为0.0749,表明各个家系间存在中度遗传分化, 9个家系仅有7.49%的变异是由群体间分化导致的, 而92.51%的变异来源于群体内。其中位点HNUMP068、HNUM125、HNUMP129和HNUMP146表现出极显著差异(P＜0.05), 表明这4个位点在不同家系中的分布不均衡, 该结果与卡方检验Hardy-Weinberg平衡结果得出的结论一致。

3.2 家系杂交组合策略及杂种优势分析

家系选育在水产经济种类育种中具有重要地位,通过家系选育进行不断遗传改进, 可以使经济性状得到改进。家系的建立和选育是否成功关键在于亲本的选择, 根据传统育种经验如亲本性状互补, 亲缘关系及地理距离远近等, 作为亲本选配的原则,准确性较小, 很难达到预期目的。分子标记能够直接反映亲本家系间基因组水平上的遗传差异, 通过分子标记遗传距离能够在一定程度上预测生物的杂种优势, 一些研究表明遗传距离与杂种优势呈显著正相关[34], 而且亲本的遗传距离越远, 其交配产生杂种优势就越明显[35]。本研究中, 9个家系的分子聚类关系树形成明显的2支, 在后续的家系选育中可以优先利用遗传距离最远且生长速率较快的F11家系与F12家系(见备注2)进行杂交, 以期获得较好的杂种优势; F11 生长快, 杂合度较低, 可通过自交以期培育出遗传稳定的优良家系。

9个家系中杂合度较高的家系, 亲本中出现F12的频率最高, 其次F19, 再次F14, 最次F17。从子代各家系的生长速率来看, 以F17为亲本的家系各数量性状生长速率显著大于以F19为亲本的家系, 这说明亲本F17的后代已经具备优良性状的稳定遗传。特别是子代F11, 可对其进一步培育, 获得具有能够稳定遗传优良性状的后代, 形成优良品种。

研究中发现, 一些微卫星位点的出现频率与亲本杂交方式以及子代杂交优势存在一定程度联系。如具有相同亲本的正反交子代F2与F6, F9与F11在一些座位上, 各基因型出现频率大体相似, 并且除F2与F6在壳宽生长速率外各数量性状生长速率差异不显著; 而F2与F6相比, 在HNUMP004座位上表现出杂合子缺失, AA型基因富集较为严重(共计出现31次)。有相同亲本的正反交子代F3与F12在体质量生长速率上存在显著差异(P＜0.05), 而F3在HNUMP001座位上, AA基因型出现15次, AB基因型出现33次, F12在此座位上, AA基因型出现34次, AB基因型出现14次, 其他性状生长速率差异不显著。这表明杂交子代只在个别数量性状有杂种优势, 获得杂种优势的程度与亲本的选择和杂交组合方式有关,这与王爱民等[31]研究结果一致。并且杂种优势和亲本杂交组合方式在子代基因型的出现频率上能够得到一定程度的反映。用最小二乘法对标记座位与马氏珠母贝生长速率进行连锁显著性检验, 未发现有与数量性状的生长速率显著相关的基因座位, 这可能与所选用的微卫星标记数量较少有关。

3.3 引物筛选过程中出现的问题分析

本研究在微卫星引物筛选的过程中遇到了较大困难, 从文献中引用的 EST-SSR, 大部分难以扩增出稳定清晰的条带, 在反复优化 PCR反应条件的过程中, 一些引物在提高退火温度之后, 能够得到稳定的扩增条带, 但扩增条带呈单态。根据引物筛选的电泳图谱, 观察条带是否清晰和检测位点是否多态来确定引物是否可用。在文献报道的退火温度基础上适当扩大范围采用梯度PCR以摸索最适温度和调整Mg2+浓度。最后只筛选出17对能够稳定扩增的引物, 其中具有多态性的引物仅6对。本实验室在研究一个野生群体和四个养殖群体的遗传多样性也使用了部分相同的引物, 同样只有17对能够稳定扩增条带的引物, 但多态性明显好于该研究中的 9个家系,不过仍低于文献的报道[23,26]。其原因可能在于, 供试群体来源于不同地理群体, 其种群的遗传背景存在较大的差异, 而且不同地理群体经过多年封闭养殖,由于人工育苗时采用较少数量的亲贝, 甚至在生产过程中重复使用养殖贝作为亲贝, 累代繁殖过程中高强度人工选育以及近交等因素, 使得养殖群体遗传多样性降低, 微卫星位点表现为杂合子缺失, 某些位点少数等位基因的富集较为严重, 稀有等位基因大量丢失。这种明显的非目的性人为选择趋向, 对种质资源的保护和持续利用是极为不利的。

致谢: 家系材料构建在中国科学院大亚湾海洋生物综合实验站完成。

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