粤东养殖区分离的2株海洋弧菌及其胞外产物对皱纹盘鲍致死毒性的初步分析

2013-10-13房沙沙林壮炳王劭雯

海洋科学 2013年8期

房沙沙, 林壮炳, 邱礽, 王劭雯, 刘晓

(1. 中国科学院海洋研究所, 山东青岛266071; 2. 中国科学院大学, 北京100039; 3. 广东省汕头市水产技术推广中心站, 广东汕头515041)

皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)自然分布于我国辽东和山东半岛水域[1], 是重要的海水养殖贝类。我国从20世纪80年代中期开始皱纹盘鲍人工养殖,主要养殖区在辽东半岛、山东半岛及福建北部和中部沿海。近30年来, 皱纹盘鲍养殖区域和规模增长迅速, 目前, 辽宁、山东、浙江、福建、广东等省沿海海域均有皱纹盘鲍养殖。

2011年秋季以来, 福建和广东东部养殖的皱纹盘鲍发生流行性病害, 培育的鲍苗死亡情况尤其严重。2011年12月初, 我们从广东汕头市南弘海珍养殖有限公司采集 2月龄患病幼鲍, 从中分离纯化得到两株细菌, 菌株编号分别为bb3和bb4, 回归感染实验表明, 菌株bb3和bb4均可致皱纹盘鲍死亡且可从接种死亡的受试鲍中重新分离得到。经16S rRNA序列分析初步鉴定此 2株细菌均为弧菌; 经 topA,ftsZ, gapA, mreB, gyrB, pyrH, recA等管家基因的序列分析进一步明确 bb3为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus), bb4为哈氏弧菌(V. harveyi)[2]。

为明确溶藻弧菌bb3、哈氏弧菌bb4与我国南方皱纹盘鲍流行性病害的关系, 我们开展了一系列的研究工作。本文报道该 2株弧菌及其胞外产物对皱纹盘鲍的致死效应、侵染途径及对抗生素的敏感性等研究结果。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 弧菌菌株

本研究使用的2株弧菌于2011年12月从汕头市南弘海珍养殖有限公司的 2月龄患病幼鲍中分离得到, 菌株bb3为溶藻弧菌、bb4为哈氏弧菌[2]。

1.1.2 实验动物

供试实验动物为我们培育的皱纹盘鲍“97”选育群体第5代。2011年4月24日在荣成亿祥水产养殖有限公司鲍育苗室繁育, 10月将部分苗种送到青岛润海海珍品养殖公司的鲍越冬车间养殖。越冬期间水温 10～15℃, 投喂人工配合饵料, 日常管理按常规生产方法进行。2012年 3月, 供试幼鲍转移到中国科学院海洋研究所培育楼暂养。暂养期间, 培育水温20℃, 投喂盐渍海带, 每天清理粪便、残饵并全量换水1次。

2012年4月, 从暂养的幼鲍中取3种规格个体用于本研究, 其中A组(壳长35.5 mm±0.9 mm、全湿重 5.58 g±0.48 g)和 C 组(壳长 24.5 mm±0.8 mm、全湿重1.84 g±0.11 g)用于比较幼鲍对弧菌的敏感性差异; 其他实验均采用B组(壳长31.2 mm±1.4 mm、全湿重 4.01 g±0.54 g)幼鲍。

侵染实验之前, 按实验设计要求选取所需幼鲍,随机分组备用。侵染处理结束后, 继续在 20℃自然海水中培育, 每天2次清理、统计死亡幼鲍。

1.2 侵染实验

1.2.1 弧菌悬浮液及胞外产物粗提液制备

弧菌悬液制备: 从LB平板上挑取单菌落接种到LB液体培养基中, 在28℃, 160 r/min条件下振荡培养10～12 h后离心收集细菌, 用无菌PBS洗涤5遍。用PBS悬浮后在600 nm波长下测定细菌悬浮液的OD值(A), 按预实验稀释平板计数法标定的每 1.0 OD悬浮液的弧菌浓度[2](bb3: 12.4×108cfu/mL; bb4:10.0×108cfu/mL)调整到侵染实验所需浓度。弧菌悬液制备后立即进行注射处理。

胞外产物粗提液制备: 参考文献[3-4]的方法略有改动, 在LB固体培养基表面覆盖1层无菌玻璃纸,取100 μL供试菌的菌液均匀涂布于灭菌玻璃纸上培养过夜, 每个菌株铺4～5个平板。每个平板用2 mL PBS洗下玻璃纸上生长的弧菌, 小心转移到无菌离心管中, 于4℃、8 500 r/min离心30 min, 取上清, 经孔径0.22 μm的纤维素膜过滤, 所得滤液即为相应菌株的胞外产物粗提液。

1.2.2 弧菌对皱纹盘鲍的致死效应研究

弧菌及其胞外产物的侵染实验在中国科学院海洋研究所培育楼进行。侵染实验共采用注射、创伤-浸浴和取食等3种方法。侵染实验全程在20℃进行,期间投喂饵料、清理粪便、换水等均采用常规方法。

注射: 本研究供试幼鲍及注射用弧菌悬液的浓度如表1所示。幼鲍阴干10～15 min后往每个供试幼鲍腹足中部的肌肉组织注射100 μL当天制备的弧菌悬浮液, 对照组注射相同体积的 PBS溶液。每个幼鲍的注射位置、深度基本接近。注射处理后约10 min,将受试幼鲍置于自然海水中培育。每处理3次重复,每个重复各注射30个幼鲍。

表1 注射侵染的分组和处理情况Tab.1 The infection experiment by intramuscular injection

创伤-浸浴:(1)创伤-浸浴处理组: 用1 mL一次性无菌注射器的针头刺入供试幼鲍的腹足部, 深度约2 mm, 每个供试鲍处理2次, 经创伤处理后, 将幼鲍放入到弧菌浓度为1.0×108cfu/mL的海水中再进行浸浴处理, 24 h后转移到自然海水中培育; (2)浸浴处理组: 未经创伤处理的幼鲍在含弧菌1.0×108cfu/mL的海水中浸浴处理24 h后转移到自然海水中培育;(3)创伤对照组: 经过创伤处理的幼鲍直接置于自然海水中培育。每处理3次重复, 每个重复各30个幼鲍。

取食: 实验开始前在供试的健康幼鲍贝壳上做标记并对供试鲍进行为期2 d的饥饿处理。然后将注射 bb4悬液后死亡的幼鲍尸体投入到受试健康鲍的养殖容器中, 12 h内将病死鲍尸从养殖容器中移除, 更换新鲜海水后再投入新的刚死亡的幼鲍尸体。实验共进行5 d, 实验期间不投喂其他饵料。观察、记录受试健康鲍对病死幼鲍软体部的取食情况并每天2次观察记录取食者的死亡现象, 连续观察1周。每组实验含健康鲍和注射弧菌后死亡的一龄鲍各10个。

1.2.3 弧菌胞外产物粗提液致死毒性的初步研究

为研究供试菌胞外产物的致死毒性, 将胞外产物粗提液分别注射到供试幼鲍腹足部肌肉组织。每处理10个个体, 每组2次重复, 对照组注射PBS溶液。注射处理后按常规方法管理, 每天2次观察统计死亡个体数。

1.3 供试弧菌的药敏试验

选取20种抗生素, 采用纸片法进行药敏试验。药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司。在每个LB固体培养基平板上涂布100 μL 浓度为5.0×108cfu/mL的菌液, 然后将药敏纸片平铺到培养基表面, 每个培养皿放置4片药敏纸片。在28℃培养16 h后测定抑菌圈直径, 依据生产厂家提供的判定标准(http://www.hangwei-media.com/tech1.asp )给出供试菌株对不同抗生素的敏感性。

1.4 数据分析

某组幼鲍在统计时段内的死亡个体数之和占该组供试鲍总数的百分比即为该组的累积死亡率, 相同处理的不同重复组之间的平均值即为该处理组的累积死亡率。采用SPSS16.0软件中的T检验和单因素方差分析检验各处理间的差异显著性, 显著性水平为0.05。

2 结果

2.1 供试弧菌注射致死的剂量效应关系

取100 μL不同浓度的弧菌悬液注射处理一龄皱纹盘鲍, 受试鲍的累积死亡率如图1所示。由图1可见, 受试鲍的累积死亡率随注射弧菌菌液浓度的增加而升高, 且受试鲍的死亡集中出现在注射处理后的前 8 d, 之后逐渐趋稳, 2周后未见出现新的死亡(数据未列)。注射浓度为 2.5×106、2.5×107、2.5×108cfu/mL的 bb3菌液后, 第14天皱纹盘鲍的累积死亡率分别是 13.95%、43.33%、78.33%; 注射浓度为2.0×106、2.0×107、2.0×108cfu/mL 的 bb4菌液后, 第 14天皱纹盘鲍的累积死亡率分别是64.04%、78.02%、94.37%; 在本研究观察的 2周内对照组的平均累积死亡率为3.33%。上述结果表明, 溶藻弧菌bb3和哈氏弧菌bb4对皱纹盘鲍均有致死效应, 哈氏弧菌bb4的致死毒性强于溶藻弧菌bb3。

2.2 不同规格皱纹盘鲍对溶藻弧菌 bb3和哈氏弧菌bb4的敏感性差异

对不同规格皱纹盘鲍分别注射 100 μL浓度为2.5×107cfu/mL的溶藻弧菌bb3或2.0×107cfu/mL的哈氏弧菌bb4悬浮液, 其中A组平均壳长35.5 mm±0.9 mm、全湿重5.58 g±0.48 g, 为大规格组; C组平均壳长24.5 mm±0.8 mm、全湿重1.84 g±0.11 g, 为小规格组。注射处理2周后统计的各组累积死亡率见图2。溶藻弧菌bb3侵染处理后, A组幼鲍的累积死亡率为20.00%, C组为58.89%, T检验结果显示A组与C组的死亡率差异显著(P＜0.05); 哈氏弧菌 bb4侵染处理后, A、C组受试鲍在2周时的累积死亡率分别为35.56%和 71.11%, 差异显著(P＜0.05)。本研究的结果表明, 受试鲍对病原弧菌的敏感性与个体规格相关, 体重小者对病原弧菌更敏感。因此, 我们在后续有关病原-宿主相互作用的研究中尽量选用规格接近的鲍作为受试对象。

图1 不同剂量弧菌悬浮液注射后幼鲍死亡率随培育时间的变化曲线Fig. 1 Cumulative mortality of juvenile abalones after vibrio challenging

2.3 供试弧菌对皱纹盘鲍侵染途径的初步分析

2.3.1 创伤-浸浴侵染

经创伤处理或不经创伤处理的皱纹盘鲍分别在含1.0×108cfu/mL的bb3或bb4弧菌悬浮液中浸浴24 h后转移到自然海水中培育2周。创伤对照组经相同创伤处理但不进行弧菌浸浴, 2周后统计各处理组的死亡率, 结果见表2。溶藻弧菌bb3的创伤-浸浴处理组累积死亡率为 17.78%, 高于单纯的浸浴处理组,显著高于创伤对照组(P＜0.05); 哈氏弧菌 bb4的创伤-浸浴处理组死亡率为31.11%, 高于浸浴处理组鲍的死亡率为 22.22%, 显著高于创伤对照组(P＜0.05)。上述结果表明, 弧菌悬浮液浸浴可致使受试鲍感染,创伤处理可使受试鲍被病原弧菌侵染的几率增加,因此, 在养殖生产中任何减少、灭除特定病原弧菌的管理措施均有望减轻病情, 并且日常管理中应尽量避免鲍遭受机械损伤。

图2 菌株bb3和bb4对不同规格受试鲍的致死毒性Fig. 2 Pathogenicity of vibrio bb3 and bb4 for abalone of different sizes

表2 弧菌创伤-浸浴处理对受试鲍死亡率的影响Tab. 2 Effects of soaking -wound treatment on cumulative mortality of abalones

2.3.2 摄食感染

在本研究的一组实验中, 我们观察到 4个供试健康鲍啃食因注射哈氏弧菌 bb4悬浮液而死亡的皱纹盘鲍的软体部组织, 这4个取食者在此后的4～7 d内相继死亡, 本研究的初步观察结果表明, 同类相食可能是鲍病原传播的途径之一。图 3是本研究的部分观察结果, 箭头所指处为皱纹盘鲍的尸体被啃食后留下的痕迹。

2.4 溶藻弧菌bb3和哈氏弧菌bb4胞外产物粗提液致死毒性的初步研究

利用平板玻璃纸覆盖法制备弧菌胞外产物粗提液, 对受试皱纹盘鲍进行足部肌肉注射处理, 每个受试鲍分别注射溶藻弧菌 bb3或哈氏弧菌 bb4的胞外产物粗提液100 μL, 对照组注射等量的PBS溶液,实验结果见图4, 注射处理后次日即发现有供试鲍死亡, 处理后第6天, bb3胞外产物粗提液注射组累积死亡率达到60%、bb4处理组死亡率高达90%, 实验期间对照组无死亡现象发生。本研究的结果表明, 不仅供试弧菌菌株侵染可导致皱纹盘鲍死亡, 它们的胞外产物对受试鲍也同样具有致死效应。但本研究仅进行了初步的定性实验, 弧菌胞外产物致死效应的剂量效应关系及致死效应机制等均值得深入研究。

图3 被同类啃食过的幼鲍尸体Fig. 3 Dead abalone bodies bited by other abalones

2.5 供试弧菌的药敏试验

应用纸片法测定供试弧菌对 20 种抗生素的敏感性, 结果见表3。结果表明, 溶藻弧菌bb3和哈氏弧菌 bb4对头孢曲松和丁胺卡那霉素均表现出高度敏感性; 此外, 溶藻弧菌bb3对庆大霉素、复达欣、卡那霉素、红霉素高度敏感; 而哈氏弧菌bb4则对四环素和强力霉素高度敏感; 但bb3和bb4却分别对8种和11种抗生素表现出抗性, 其中青霉素、氨苄西林、苯唑西林、哌拉西林、羧苄青霉素和先锋霉素Ⅳ、先锋霉素Ⅵ、头孢呋辛等8种是2株供试弧菌均具抗药性的抗生素。

表3 菌株bb3和bb4的药敏试验结果Tab. 3 Antibiotic susceptibility tests of bb3 and bb4

3 讨论

我国皱纹盘鲍和杂色鲍养殖区均曾发生大面积的流行性病害, 细菌[5-7]和病毒[8-10]是历次流行性死亡的主要病原生物[11], 而海洋弧菌是细菌性病原中最主要的一个类群。

皱纹盘鲍的自然分布区和传统养殖区在我国北方的黄海海域, 我国皱纹盘鲍养殖区自 1992年开始曾发生非常严重的流行性病害, 研究人员先后从病患样本中分离得到河流弧菌II(V. fluvialisⅡ)[5,12]、坎氏弧菌(V. campbellii)[6]和创伤弧菌(V. vulnificus)[7],侵染实验表明它们均为皱纹盘鲍的致病菌。此后,从我国南方养殖的杂色鲍中陆续分离得到亮弧菌(V.splendidus)[13]、塔氏弧菌(V. tubiashii)[14]、溶藻弧菌[15-17]、副溶血弧菌(V. paralaemolyticus)[15-16]、霍乱弧菌(V.cholera)[16]、溶珊瑚弧菌(V. coralliiluyitcus)[17]及哈氏弧菌[18-19]等致病性弧菌。本研究从我国粤东养殖区分离得到的这2株弧菌分别为溶藻弧菌(bb3)和哈氏弧菌(bb4), 幼鲍被bb3或bb4感染后, 附着力普遍降低, 死亡个体外套膜收缩、腹足肌肉僵硬并有部分个体的腹足部出现白色脓疱[2]。侵染实验表明菌株bb3和bb4及其胞外产物在20℃水温下对1龄皱纹盘鲍表现出较强的致死毒性, 它们对皱纹盘鲍的致死毒性与弧菌浓度呈正相关、与皱纹盘鲍个体规格负相关, 我们的初步结果表明 bb3和 bb4是皱纹盘鲍的致病菌, 它们可能是引起2011年秋冬季粤东地区养殖皱纹盘鲍大规模死亡的重要病原菌。

溶藻弧菌和哈氏弧菌此前已从闽粤养殖的杂色鲍中分离得到并被证明是杂色鲍的致病菌[15-19], 同时溶藻弧菌和哈氏弧菌也是中国北方养殖的水产动植物的常见病原菌, 但以往未见从中国北方分布或养殖的鲍科动物中分离出溶藻弧菌和哈氏弧菌的报道。本研究所用病原菌分离自广东汕头市南弘海珍养殖有限公司的皱纹盘鲍病患样本, 该公司所处的汕头市海门湾弧菌含量较高, 且以往从该公司养殖的杂色鲍中曾分离到哈氏弧菌, 本研究分离的弧菌菌株与以往从该海区养殖的杂色鲍中分离的弧菌菌株有哪些异同, 值得进一步研究。

鲍以海藻为食, 但在长期的研究中我们多次观察到皱纹盘鲍啃食同类尸体的现象。本研究对皱纹盘鲍的同类相食行为在病害传播中的作用进行了初步研究, 首次观察到致病海洋弧菌可以通过宿主被健康鲍取食而传播给健康个体, 这可能是鲍病原生物横向传播的重要方式之一。因此, 我们建议在鲍人工养殖过程中及时清除病死个体。及时清除病死个体不仅可避免尸体腐烂导致养殖水体的水质败坏,而且可切断病原生物在养殖生物之间的传播。

本文对菌株bb3和bb4及其胞外产物的侵染毒性、侵染途径及对抗生素的敏感性进行了初步研究,结果已反映出我国水产养殖产业存在的一些现象可能导致的危害, 比如: 对水产生物异地移养缺乏制约客观上增加了病害传播的速度和范围、并增大了病原生物在物种之间横向传播的风险; 使用抗生素不规范导致病原微生物出现耐药性——在本研究中我们测试了供试弧菌对20种抗生素的敏感性, 发现仅有2种抗生素是这2株弧菌均高度敏感的, 但这2株海洋弧菌同时表现出抗性的抗生素却达到 8种之多。菌株 bb3和 bb4均具备抗药性的这 8种抗生素分别属于青霉素类和头孢菌素类, 是人类医学及畜牧、水产业中最广泛使用的2大类抗生素。

致谢: 感谢孙黎博士对本文提出有益建议。

[1]吕端华. 中国近海鲍科的研究[C]//中国科学院海洋研究所.海洋科学集刊(14). 北京: 科学出版社, 1978:89-98.

[2]房沙沙. 中国南海养殖区分离的两株海洋弧菌对皱纹盘鲍致病性的研究[D]. 青岛: 中国科学院大学,2012.

[3]王斌, 于兰萍, 袁甜, 等. 哈氏弧菌胞外产物对红鳍东方鲀的致病性[J]. 中国水产科学, 2010, 17(1):88-96.

[4]金珊, 郑天伦, 王国良, 等. 溶藻弧菌胞外产物对大黄鱼的致病性[J]. 中国兽医学报, 2004, 24(5):439-441.

[5]刘金屏, 聂丽平, 李太武, 等. 皱纹盘鲍(Haliotis discus)脓疱病的研究[J]. 中国水产科学, 1995, 2(2):78-84.

[6]马健民, 王琦, 马福恒, 等. 皱纹盘鲍脓毒败血症病原菌的发现及初步研究[J]. 水产学报, 1996, 20(4):332-336.

[7]王崇明, 杨冰, 宋晓玲, 等. 应用双抗夹心ELISA法检测皱纹盘鲍致病病原——创伤弧菌的研究[J]. 海洋水产研究, 1999, 20(1): 30-34.

[8]黄印尧, 吴文忠, 颜江华, 等. 一起毁灭性鲍鱼病毒病的调查[J]. 福建畜牧兽医, 1999, 21(3): 4-5.

[9]王军, 苏永全, 张蕉南, 等. 1999年春季东山九孔鲍暴发性病害研究[J]. 厦门大学学报(自然科学版),1999, 38(5): 641-644.

[10]吕军仪, 陈志胜, 杨大伟, 等. 广东省粤东地区工厂化高密度养鲍业病害情况调查报告[J]. 水产科技,1999(4): 1-4.

[11]Nie Zongqing, Wang Suping. The Status of abalone culture in China[J]. Journal of Shellfish Research, 2004,23(4): 941-945.