于泽洋，于 涛，赵长福，王志申

（吉林大学中日联谊医院 骨科，吉林 长春130033）

骨折愈合是一个极其复杂的骨再生过程。其修复的过程就是正常胚胎骨发生过程的重演，是一系列的细胞和细胞外基质的变化过程。骨折愈合机制受到机体及局部环境的多层面、多途径的调节，在不同的愈合阶段有不同的细胞参与，且有许多生长因子表达水平的改变，从而影响骨折愈合速度［1－3］。

神经营养因子（neurot rophic factors，NTFs）是由多种细胞所分泌的一类对中枢和外周神经系统发挥营养作用的非常规营养物质，通常为大分子蛋白质或小分子肽类物质［4］。它们可调节细胞的生长分化，促进和支持靶细胞的存活、生长及发育，调节神经系统的代谢和功能活动，它们对神经系统疾病及神经系统损伤后的再生修复也有着重要作用。

近来，随着研究的深入，不断地发现有新的种类的神经营养因子。目前关于它们的分类及归属仍不十分明确，研究比较集中的主要有神经生长因子（nerve growth factor，NGF），脑源性神经营养因子（brain derived neurot rophic factor，BDNF），神经营养素（neurot rophin，NTs），睫状神经营养因子（ciliary neurot rophic factor，CNTF），胶质源性神经营养因子（glial derived neurot rophic factor，GDNF），胰岛素样生长因子（insulin－like growth factor，IGF），转化生长因子（transforming growth factor，TGFs），成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF），表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF），血小板源性生长因子（platelet derived growth factor，PDGF），血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等。

对骨折愈合中神经营养因子表达的研究表明，骨痂形成过程中有多种NTFs表达，包括BDNF，NGF和神经营养因子23（NT23）。骨形成细胞有NTFs受体trkA 和trkC的表达［5－7］，提示 NTFs涉及骨形成的调节，但机制不清。目前已知，NGF对骨折修复的研究始于Eppley等人，他们在应用NGF修复兔下颌神经缺损的实验中，不仅证实NGF能促进神经轴突再生，同时发现在再生轴突周围有新生类骨质生成［8］。BDNF是NTFs家族中重要成员，是由神经元的靶细胞分泌，逆向营养神经元，对神经系统具有广泛作用，尤其可以促进感觉神经元谱系分化，维持运动神经元的存活，对神经细胞的生长发育及保护修复有重要作用，其作用范围甚至超过NGF。在骨折愈合过程中，神经支配和调节也有着明显的影响。脑外伤病人骨折愈合较快；此外，一些神经疾病患者的骨骼外成骨量也较多。

因此，本实验围绕神经因素应用于干细胞工程与骨组织工程的可行性方面，从体外实验，对神经营养因子与骨形成的关系进行讨论。探讨骨折修复作用中BDNF对骨髓间充质干细胞的成骨细胞诱导分化、损伤修复的作用。证实神经营养对骨形成的作用，为神经营养因素应用于骨组织工程种子细胞研究打下基础。

1 材料和方法

1．1 pECFP－C1－BDNF重组质粒载体的构建

EcoRⅠ及SalⅠ双酶切已构建的pUCm－T－BDNF质粒及pECFP－C1质粒，琼脂糖电泳鉴定后回收纯化目的片段。T4DNA连接酶作用下将测序正确的BDNF基因片段与双酶切后的载体质粒4℃连接过夜。转化感受态大肠杆菌DH5α。小量抽提质粒，EcoRⅠ／SalⅠ及EcoRⅠ／BamHⅠ两种双酶切方案进行鉴定。

1．2 大鼠骨髓间充质干细胞的提取与培养

无菌条件下获取的大鼠骨髓，吹打制成均匀的细胞悬液。将骨髓细胞悬液加于Percoll淋巴细胞分离液液面上（2∶1比例）。3 000rpm离心10min。去上清，吸取中间白膜层，加入PBS清洗2遍。1 800 r／min，离心10min。用含10%FBS的L－DMEM培养基悬浮细胞，计数，将细胞密度调至2×106／ml，接种于25mm2培养瓶中。置于CO2培养箱中，37℃、5%CO2条件下培养。每隔3d换液。

原代细胞长至80%－90%汇合时，进行传代培养。胰酶消化后，加入含10%FCS的L－DMEM培养基重新悬浮，按1∶2比例传代接种培养。

1．3 pECFP－C1－BDNF质粒转染骨髓间充质干细胞

将细胞等量分到6孔培养板中培养，每孔约5×105个／ml，直至细胞密度约80%左右时进行转染。将FuGENE HD转染试剂、无血清和抗生素的培养液恢复至室温。转染试剂与质粒以3∶2的比例混合。转染48h后收集细胞，以相应的未经转染的细胞或转染相应的空质粒的细胞作为阴性对照。Western Blot检测转染后BMSCs BDNF的表达。

1．4 骨髓间充质干细胞向成骨细胞的诱导及鉴定

取P4代BMSCs，细胞正常消化，接种于6孔板内，接种密度为1×104个／ml，正常培养24h。转染pECFP－C1－BDNF质粒48h后，然后更换成骨诱导培养基，每2－3天换液一次，连续诱导3周。Von Kossa染色。将成骨诱导后的细胞，弃去培养基，PBS冲洗3遍，95%乙醇室温固定10min；放入2%硝酸银，置于强光处作用15－60min；蒸馏水冲洗3遍，2%硫代硫酸钠还原1h；流水冲洗5min，1%伊红复染5min，冲洗，显微镜观察。

1．5 Western Blot检测

收集各组细胞总蛋白。制备12%SDS－聚丙烯酰胺凝胶，取100μg总蛋白上样，电泳1．5h；室温、恒压220V条件下，半干转移法转膜1h。PBST配制的5%脱脂奶粉溶液用作封闭液，室温封闭1h；兔抗BDNF多克隆抗体（1∶1 000）4℃孵育过夜；PBST漂洗3次，每次10min；加入HRP－抗兔IgG（1∶5 000）孵育1h，PBST 洗3次，每次10min；PBS洗膜10min；ECL反应3min后，暗室中X光片曝光；室温显影、定影。用凝胶成像系统对胶片进行薄层密度扫描，记录相应条带的透射光积分光密度（IOD）值反映蛋白含量。

1．6 碱性磷酸酶的检测

经重组质粒pECFP－C1－BDNF转染的细胞与未转染的细胞分别制成5×104个／孔的密度，铺于24孔板中，每孔1ml，检测碱性磷酸酶含量的变化情况。以未转染的细胞作对照。采用碱性磷酸酶定量检测试剂盒检测培养液中碱性磷酸酶的含量。

2 结果

2．1 pECFP－C1－BDNF重组质粒载体的构建

pUCm－T－BDNF克隆后经EcoRⅠ及SalⅠ双酶切后得到BDNF基因目的片段，回收纯化测序结果正确无突变或缺失。重组质粒pECFP－C1－BDNF经EcoRⅠ／SalⅠ及EcoRⅠ／BamHⅠ两种双酶切方案鉴定、测序后得出相同结果（见图1．A，B）。

2．2 骨髓间充质干细胞的分离和培养

倒置显微镜下观察，原代细胞接种24h后，部分细胞贴壁，贴壁细胞呈长梭型。接种3d后，长梭形细胞增多（图2．A）。培养5d左右，细胞胞体变大呈典型成纤维细胞样，大量细胞向外放射状生长，细胞排列整齐，克隆显著增多并融合成片。原代细胞培养7－10d左右即可传代。培养在25cm2培养瓶中，第3代以上的细胞按1∶2比例传代6d可长至80%左右，第20代左右的细胞按1∶3比例传代仅3d可达90%以上汇合。

图1 A：pECFP－C1－BDNF重组质粒经EcoRⅠ／SalⅠ酶切鉴定。B：pECFP－C1－BDNF经EcoRⅠ／BamHⅠ酶切鉴定

图2 人骨髓间充质干细胞形态图

2．3 pECFP－C1－BDNF质粒转染骨髓间充质干细胞

荧 光 显 微 镜 下 可 见 pECFP－C1－BDNF 转 染BMSCs效率可达80%左右（图3．A，B）。Western blot检测结果显示，pECFP－C1－BDNF转染BMSCs 48h表达分子量约为30kD的融合蛋白条带（图3．C）。

图3 A，B：pECFP－C1－BDNF重组质粒转染BMSCs。C：Western blot检测pECFP－C1－BDNF转染BMSCs后BDNF蛋白表达。

2．4 转染pECFP－C1－BDNF质粒的BMSCs向成骨细胞诱导分化

转染pECFP－C1－BDNF与未转染质粒的BMSCs组均加入成骨诱导培养基培养。细胞诱导成骨培养5－8天后，细胞有长梭形逐渐变成多角形或不规则状，并且体积增大。诱导21天后，有钙结节产生。钙结节的形成为成骨细胞特有。我们利用Von kussa染色矿化结节的经典方法，细胞钙结节的主要成分钙盐与硝酸银复分解形成可被还原的银盐，在强光或式紫外光下生成黑色金属银。因此在染色结束后，粉红色背景上有黑色颗粒的产生。

随机16个视野中观察，结果发现转染pECFPC1－BDNF质粒组，细胞钙结节的Von kussa染色黑色颗粒含量和范围都较未转染质粒组的多，初步证明了，转染pECFP－C1－BDNF质粒后BMSCs向成骨细胞诱导分化的效率比未转染质粒的BMSCs较高。BDNF在细胞中的表达有利于BMSCs向成骨细胞的诱导分化。

图4 转染pECFP－C1－BDNF质粒的BMSCs向成骨细胞诱导分化后钙结节形成的Von kussa染色图

2．5 碱性磷酸酶合成变化

当诱导培养至第9天时，转染重组质粒组BMSCs细胞与未转染组细胞碱性磷酸酶含量与对照组比较均显著升高。未转染组细胞碱性磷酸酶含量为（4．78±0．30）IU／ml；而转染的BMSCs细胞碱性磷酸酶含量为（5．88±0．19）IU／ml。提示pECFP－C1－BDNF转染BMSCs细胞后，BDNF蛋白的表达使细胞更易于向成骨细胞诱导分化，使细胞所分泌的碱性磷酸酶量呈显著性升高（P＜0．05）。

图5 转染pECFP－C1－BDNF质粒后BMSCs向成骨细胞诱导时碱性磷酸酶合成含量的变化

3 讨论

骨折愈合是指骨折断端间的组织修复反应，是成骨细胞、破骨细胞及其他多种细胞和细胞因子参与的复杂过程。骨折不同的愈合阶段有不同的细胞及细胞因子参与，骨形成过程受多种因素调控［5－7］。

骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是骨髓内除造血干细胞之外的一类具有多向分化潜能的成体干细胞，是骨髓基质的重要组成成分［9－11］。在一定的诱导条件下，BMSCs具有向成骨细胞，软骨细胞，神经细胞，脂肪细胞，心肌细胞等多向分化的能力，并可通过分泌一些可溶解因子，如脑源性神经营养因子（BDNF），bFGF和睫状神经营养因子（CNTF）等促进神经再生。BMSCs由于具有多分化潜能，容易在体外扩增，容易转染等特点而成为基因治疗的良好靶细胞。BMSCs已经在众多临床前期实验中被用于修复各种组织损伤。已有研究表明，骨折治疗中，导入NGF－BMSC，不仅能诱导BMSC向成骨细胞转变，它分泌的NGF还能加速骨折愈合，从而达到更理想的效果。Eppley等发现，NGF具有骨折修复的潜能［8，12，13］。

BDNF是NTFs家族中重要成员，是由神经元的靶细胞分泌，逆向营养神经元，对神经系统具有广泛作用，尤其可以促进感觉神经元谱系分化，维持运动神经元的存活，对神经细胞的生长发育及保护修复有重要作用，其作用范围甚至超过NGF。

本实验成功构建了真核表达质粒pECFP－C1－BDNF。在研究中发现，转染pECFP－C1－BDNF质粒可以有效的在BMSCs内表达BDNF蛋白，并且加速BMSCs向成骨细胞的诱导分化的进程，有利用BMSCs在骨损伤部位分化为成骨细胞，促进骨折愈合，对骨折后损伤部位的组织修复等具有重要的作用。本研究对BDNF基因修饰型细胞移植治疗临床疾病提供了一条有效、安全的新的发展方向。

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