王雅雯，于 宏，王世宝，黄映辉

（吉林大学中日联谊医院 血液肿瘤科，吉林 长春130033）

YWHAZ（又名14－3－3ζ）属于14－3－3基因家族，分子量约28－33kD。人类基因组中存在7种14－3－3家族基因，分别是α／β、ε、η、γ、τ／θ、δ／ζ和σ，其中α、δ和τ分别是β、ζ和θ的磷酸化形式。14－3－3蛋白表达于从植物到动物的所有真核细胞中，且氨基酸序列具有高度同源性，不同种属的每个亚型序列也基本相同［1］。14－3－3蛋白主要分布于细胞质，自然状态下以同源二聚体（hormodimer）或异源二聚体（heterodimer）的形式存在，通过特异性识别底物上的磷酸化基序RSXpSXP或RXXXpSXP而与该底物结合［2］，在信号传导、细胞周期以及细胞凋亡的调控等方面发挥重要作用［3］。最近研究发现与正常细胞相比，肺癌、乳腺癌、头颈鳞癌、胃癌［4－7］等多种肿瘤细胞中均有YWHAZ高表达，且表达程度与肿瘤恶行性呈一定相关性［8］。YWHAZ与肿瘤的发生发展关系密切，已然成为极具研究价值的潜在原癌基因，但其作用机制鲜有报道。本实验将构建YWHAZ重组腺病毒、YWHAZ重组逆转录病毒并在293T细胞中验证基因表达情况，为体内外进一步研究YWHAZ基因及其相关信号通路在肿瘤发生发展中的作用奠定基础。

1 材料和方法

重组穿梭质粒pacAd5CMV－IRES－GFP、腺病毒骨架载体pacAd5 9．2－100（Cell BioLabs公司）；重组逆转录病毒质粒PLXSN－IRES－GFP（实验室现有）；E．coliDH5α感受态细胞（TIANZHEN BIOTECH 公司）；腺病毒包装细胞293T（实验室现有）；逆转录病毒包装细胞Ampho293（实验室现有）。

1．2 生化试剂

限制性内切酶EcoRⅠ、calI、BamH和PacⅠ（New England Biolabs公司）；DNA 纯化回收试剂盒（Roche公司）；碱性磷酸化酶、反转录试剂盒、PCR试剂盒、T4DNA 连接酶、DL 10，000DNA marker、Trans 2KDNA marker（TaKaRa公司）；100bp DNA marker、质粒DNA 小／大量提取试剂盒（Bioscience 公司）；FuGENE Transfection Reagent（Invitrogen公司）；DMEM 高糖细胞培养基（Invitrogen 公 司 ）；胎 牛 血 清 （Biological Industries）；病毒纯化试剂盒（Cell BioLabs公司）；上海生工生物工程技术服务有限公司完成引物合成及重组质粒测序。

1．3 pacAd5－YWHAZ重组腺病毒质粒的构建与鉴定

用 上 游 引 物：5′－CTATCGATTGGATGGATAAAAATGAAGCT－3′和下游引物：5′－GCGGATCCTTAATTTTCCCCTCC－3′，从293T 细胞中扩增YWHAZ基因。PCR产物用限制性内切酶claI和BamHI双酶切，纯化回收后，经T4DNA连接酶连接于 pacAd5CMV－IRES－GFP 的 claI和BamHI多克隆位点，16℃定向连接12h后转化E．coliDH5α感受态细胞。Ampicillin抗性培养基筛选、扩增目的菌种。小量提取质粒，用claI和Bam－HI双酶切鉴定。

1．4 PLXSN－YWHAZ重组逆转录病毒质粒的构建与鉴定

用 上 游 引 物：5′－CCGCAATTCATGGATGGATAAAAATGAAGCT－3′和下游引物：5′－CCGGAATTCTTAATTTTCCCCTCC－3′，从 293T 细胞中扩增YWHAZ基因。PCR产物用限制性内切酶EcoRI单酶切，再经碱性磷酸酶去磷酸化，纯化回收后经T4DNA连接酶连接于PLXSN－IRESGFP的EcoRI多克隆位点。16℃定向连接12h后转化E．coliDH5α感受态细胞。Ampicillin抗性培养基筛选、扩增目的菌种。小量提取质粒，用EcoRI单酶切鉴定。

1．5 PacAd5－YWHAZ重组腺病毒的包装、扩增

PacI单酶切pacAd5－GFP－YWHAZ及pacAd5 9．2－100，去除pacAd5 9．2－100中的ori和 Amp等质粒构件。用FuGENE Transfection Reagent将酶切后的两个质粒共转染至预铺有293T细胞的60mm培养皿（见图1A）。24小时后30%细胞表达绿色荧光（见图1B），7天后80%细胞表达绿色荧光（见图1C）且出现完全细胞病变效应（cytopathic effect）。收获细胞，－80℃与37℃反复冻融三次获得pacAd5－GFP－YWHAZ第一代腺病毒。重复感染293T细胞，大量扩增病毒。经病毒纯化试剂盒（ViraBind Adenovirus purification Kit）纯 化 后－80℃冻存备用。

图1 A光镜下未感染病毒的293T细胞；B pacAd5－YWHAZ及包装质粒共转染293T细胞24小时；C pacAd5－YWHAZ及包装质粒共转染293T细胞7天；D PLXSN－GFP－YWHAZ转染ampho293细胞并筛选6天。

1．6 PLXSN－GFP－YWHAZ重组逆转录病毒的包装、扩增

Ampho293细胞带有逆转录病毒包装基因，直接用 FuGENE Transfection Reagent将 PLXSNGFP－YWHAZ质粒转染至预铺有Ampho293细胞的60mm培养皿，24小时后40%细胞表达绿色荧光。G418（500μg／ml）筛选稳转细胞，3天后60%细胞表达绿色荧光，6天后90%细胞表达绿色荧光（见图1D），收取细胞上清液，－80℃冻存保存病毒。

1．7 病毒感染效果及基因过表达检测 分别用Pac－Ad5－GFP－YWHAZ 重 组 腺 病 毒、PLXSN－GFPYWHAZ重组逆转录病毒感染293T细胞，24、48、72小时后观察细胞绿色荧光表达情况，验证病毒侵染效果。提取正常293T及病毒感染的293T的mRNA，PCR检测YWHAZ基因表达情况。

2 结果

2．1 重组质粒的酶切鉴定

重 组 腺 病 毒 质 粒 pacAd5－GFP－YWHAZ 经claI、BamHI双酶切，重组逆转录病毒质粒PLXSNGFP－YWHAZ经EcoRI单酶切，琼脂糖凝胶电泳，均获得大小约为700bp（YWHAZ）、7kb（载体）片段。质粒构建正确（见图2A）。

2．2 重组质粒测序及PCR扩增鉴定

重组腺病毒质粒pacAd5－GFP－YWHAZ、重组逆转录病毒质粒PLXSN－GFP－YWHAZ进行基因测序，测序正确（见图2B、C）。分别以两重组质粒为模板，YWHAZ特异引物进行PCR反应，获得359 bp目的基因。证明重组质粒构建成功（见图2D）。

2．3 病毒感染效果及YWHAZ基因过表达检测

分别用 PacAd5－GFP－YWHAZ 重组腺病毒、PLXSN－GFP－YWHAZ重组逆转录病毒感染6孔板中293T细胞，24小时绿色荧光40%、30%；48小时绿色荧光60%、40%；72小时绿色荧光80%、60%（图3A、B）。提取正常293T细胞及两种病毒分别感染的293T细胞的mRNA，逆转录后调整同一模板浓度进行PCR反应，病毒感染的293T细胞与未感染293T细胞相比，显著高表达YWHAZ基因（图3C），证明两种YWHAZ病毒均制备成功。

图2 A重组质粒的酶切鉴定：○MDL 10，000DNA marker；①pacAd5－GFP－YWHAZ双酶切可见700bp目的片段；②PLXSN－GFP－YWHAZ单酶切可见700bp目的片段。B重组腺病毒质粒中YWHAZ测序图。C重组逆转录病毒质粒中YWHAZ测序图。D两种重组病毒质粒为模板，PCR可获得目的基因：○MTrans 2K DNA marker；①重组腺病毒质粒为模板；②重组逆转录病毒质粒为模板。

图3 A重组腺病毒感染293T细胞3天；B重组逆转录病毒感染293T细胞3天；C病毒感染的293T细胞显著高表达YWHAZ基因：○M100bp DNA marker；①未感染病毒的293T细胞中扩增YWHAZ基因，②③分别为从重组腺病毒及重组逆转录病毒感染的293T细胞中扩增YWHAZ基因。

3 讨论

大量研究发现，肿瘤的发生发展及转移系多种基因突变的结果。原癌基因的发现为解释肿瘤发生、早期诊断肿瘤及肿瘤靶向治疗提供了新思路。YWHAZ是最新发现的一个原癌基因，其在正常组织中少量存在，但在许多肿瘤组织中高表达［8］。相关研究发现其可调控细胞周期，明显增加G2期细胞比率，增强细胞增殖，明显抑制细胞凋亡［9］。转移性肺癌中该基因表达明显高于非转移性癌，提示YWHAZ与肿瘤转移有关［10］。高表达YWHAZ基因的乳腺癌表现出对他莫昔芬强耐药性［11］，顺铂耐药的卵巢癌细胞也高表达YWHAZ基因［12］，说明该基因可能通过某些机制导致了肿瘤的药物抵抗［13］。越来越多的实验结果表明YWHAZ与肿瘤发生、转移及耐药有关［14］，但其作用机制鲜有报道。构建载体，达到过表达该基因的目的，用以深入研究该基因功能及作用机制成为亟待解决的问题。本实验从过表达病毒的构建入手，成功构建了可高效表达目的基因的重组腺病毒及逆转录病毒，可高效侵染目的细胞并获得稳定表达YWHAZ的细胞系。这一实验成果是后续该基因功能性研究的基础，为深入研究该基因提供了必要的工具。

本实验采用最新的RAPAd CMV Adenoviral Bicistronic Expression System 构建 YWHAZ重组腺病毒。该系统3周即可完成重组腺病毒的包装、扩增，极大缩短了实验时间，且包装出的腺病毒转染效率高、感染细胞范围广、可高效介导基因的体内外转移［15］。本实验首次用自带包装信息的 Ampho293包装、扩增YWHAZ重组逆转录病毒。既避免了共转染包装质粒，简化了实验步骤；又筛选出稳转细胞系，持续产生重组逆转录病毒。逆转录病毒可使YWHAZ插入宿主细胞染色体，使目的细胞稳定的过表达该基因［16］，为后续实验研究奠定了基础。两种过表达质粒的成功构建为体内外进一步研究YWHAZ基因及其相关信号通路在肿瘤发生发展中的作用奠定了基础。

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