王力玄，任 锦，吴艳峰，周佳莹＊

（1．吉林大学白求恩医学院09级临床医学专业，吉林 长春130021；2．吉林大学第二医院 呼吸内科，吉林 长春130041）

肺癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，全身化疗是目前大多数肺癌患者的主要治疗手段。但是，多药耐药（MDR）严重影响化疗效果及预后，是临床亟待解决的问题［1］。因此，深入了解肺癌的耐药机制，尝试新的方法以防止或逆转耐药性，对提高肺癌的治疗效果及患者生存率有重要意义。本研究应用超抗原葡萄球菌肠毒素A（SEA）观察其对人肺巨细胞癌株（PLA801D）细胞的生物学行为，旨在为人肺癌的治疗提供理论依据。

1 材料和方法

1．1 材料

1．1．1 PLA801D细胞株由北京解放军总医院提供，SEA由军事医学科学院微生物流行病学研究所提供，噻唑蓝（MTT）试剂，RPMI 1640培养基为美国sigma公司产品，胎牛血清购于长春生物制品研究所。

1．2 方法

1．2．1 MTT比色法 取对数生长期的PLA801D细胞，0．25%胰蛋白酶消化，调细胞数为2×105／ml，接种于96孔塑料培养板内每孔100μl，当细胞生长达到80%汇合时，分组，0ng／ml组、20ng／ml组、40ng／ml组和80ng／ml组，每个浓度10复孔，静止培养24h，于结束前6h加入MTT试剂20nl／孔，终浓度为500mg／L继续培养6h后，弃上清，每孔内加入DMSO（二甲基亚砜）150nl，振荡5min，使MTT还原产物完全溶解，应用酶标仪于570nm处测定各孔吸光度A值，按下列公式计算PLA801D细胞增殖抑制率，每组实验重复3次，取平均值。

PLA801D细胞抑制率＝（1－加药组细胞A值÷对照组细胞A值）×100%

1．2．2 流式细胞仪检测细胞周期 细胞培养及分组同1．2．1，不同之处是将96孔塑料培养板改为25毫升培养瓶进行，每个浓度3瓶，培养结束后用0．25%胰蛋白酶消化，收集细胞PBS洗二次，70%冷乙醇固定，4℃内保存，上机前过40目网，调细胞数1×106／ml，PI染色，流式细胞仪检测，细胞周期结果以 Modiff 2．0软件分析。

1．2．3 透射电子显微镜技术 细胞培养及分组同1．2．2，收集不同浓度的SEA作用后的PLA801D细胞，移入锥型离心管内，离心弃上清，应用2．5%戊二醛前固定，1%锇酸后固定，环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸铅－铀双重染色，透射电子显微镜观察并拍照。

1．2．4 统计学处理 所有数据结果以¯x±s%表示，统计学采用SPSS 11．0软件分析，组间比较采用χ2检验。

2 结果

2．1 MTT结果 不同浓度的SEA对PLA801D细胞增殖均有抑制作用，且呈剂量依赖性，与对照组相比差异有显著意义。见表1。

2．2 流式细胞仪结果 不同浓度的SEA对PLA801D细胞增殖周期均有影响。G1期细胞增多，S期细胞减少，G2／M期相对增多，组间比较差异显著。见表2。

表1 SEA对PLA801D细胞增殖抑制率

表2 SEA对PLA801D细胞增殖周期各时相影响及凋亡率

2．3 透射电子显微镜观察结果 透射电子显微镜观察不同浓度的SEA对PLA801D细胞的超微结构改变，可见线粒体肿胀、有大量空泡形成、细胞核染色质趋边凝集，可见凋亡小体改变。见图1、2。

图1 20ng／L SEA对PLA801D细胞作用，可见线粒体肿胀、有空泡形成（5000×）

图2 80ng／L SEA对PLA801D细胞作用，可见染色质趋边凝集、可见凋亡小体（5000×）

3 讨论

肿瘤生物治疗是一类应用细胞生物学和分子生物学手段对机体免疫系统或肿瘤生长进行调节，从而抑制肿瘤生长［2］。因此，本研究应用超抗原SEA观察其对PLA801D细胞的生物学行为变化，SEA是一组对热稳定的可溶性蛋白质，能抵抗胃肠液中蛋白水解酶的水解作用，是食物中毒和毒素性休克的常见病因［3］。MTT结果显示，不同浓度的SEA对PLA801D细胞增殖抑制率分别为22．8%、33．7%和42．1%，具有明显的剂量依赖性，与对照组相比差异非常显著，P＜0．01。因为 MTT试剂可被哺乳动物活细胞线粒体中的脱氢酶还原成蓝色的甲臜颗粒，且甲臜生成的量与活细胞数目及细胞活化状态呈线性关系。因此，该实验被广泛用于抗肿瘤药物筛选和细胞毒性实验研究，具有一定的客观性和实用性。

流式细胞仪结果显示，不同浓度的SEA对PLA801D细胞周期进程均有影响，SEA可抑制G1期细胞向S期转化进程，从而使G1期细胞增多，S期细胞减少，G2／M期细胞相对增多，G1期细胞又称细胞复制前期，G1期是制造和产生rRNA、mRNA和tRNA及核蛋白体，同时G1期也是多种化学药物作用的敏感点［4］。因此，抑制G1期细胞的进程从而使细胞增殖变缓，不能进入S期，造成S期细胞减少，达到抑制肿瘤增殖的目的，而G2／M期细胞增多是细胞损伤的普遍反映［5］。G2／M期是细胞周期的两个检查点之一，是细胞增殖的重要阶段，多种DNA损伤剂不仅可引起G1期阻滞，也可引起G2／M期阻滞，由于G2／M期阻滞在细胞增殖和凋亡中的作用，使人们联想到它可能与细胞基因组不稳定性，肿瘤发生和治疗密切相关。因此，这方面研究日益受到重视。

综上所述，本研究应用SEA体外观察其对PLA801D细胞生物学行为影响，获得了较为满意的结果。证明SEA具有直接的细胞毒作用，与文献报道相一致［6］，可以用于肿瘤局部免疫治疗，具有一定的优越性。

［1］Anglim PP，Alonzo TA，Laord－Offringa IA．DNA methylation based biomarkers for early detection of non－small cell lung cancer：an up－date［J］．Mol Cancer，2008，7：7．

［2］黄 健，李官成．抗体药物用于肿瘤治疗的研究进展［J］．国际肿瘤学杂志，2008，35（5）：351．

［3］Thomas D，Chou S，Dauwalder O，et al．Diversity in Staphylococcus aureus enterotoxins［J］．Chem Immunol Allergy，2007，93：24．

［4］Martin LG，Demers GW，Galloway DW，Disrup－tion of the G1／S traansition in human Papiloma Viras type／6E7－expressing human cells in associated regulation of cyclin E ［J］．Virol，1998，72（2）：975．

［5］Eillnger Ziegelbauer H，Karasuyama H，Yamada E，et al．Ste20－like kinase（SLK），a regulatory kinase for polo－like（PLK）during the G2／M transition in somatic cells［J］．Genes Celss，2005（6）：491．

［6］张 云，孙嘉琳，王 雪，等．SEA体内杀伤S180肉瘤效果及其细胞因子测定［J］．天津医药，2010，38（4）：313．