彭佳丽，胡国良，王小莺，郭小权，曹华斌，胡小明

（1．江西农业大学动物科学技术学院，江西 南昌330045；2．江西省余江县畜牧兽医局，江西 余江335200）

脂肪肝综合征是一种脂类代谢紊乱疾病，以肝脏脂肪过度沉积或伴有肝脏出血为特征，发生率与遗传、环境、内分泌、激素的影响，有毒物质等因素有关。壳聚糖是甲壳质经脱乙酰反应后的产品，属于氨基多糖，被誉为生命要素之一，与机体之间有良好的生物相容性，并且具有多种药理作用，提高机体免疫力，抗肿瘤，抗氧化，抗自由基。中医治疗脂肪肝主要以化痰祛湿、活血化癖、疏肝解郁、健脾消导为主，同时辅以清热解毒、利胆化积、补肾养肝等方法［1］。本试验将壳聚糖合并中药，以常用药氯化胆碱为对照药物，研究复方壳聚糖中药制剂对蛋鸡脂肪肝的治疗效果及作用机理，为中药应用于临床降低脂肪肝发病率提供理论基础。

1 材料

1．1 试验动物 海褐蓝蛋鸡280日龄120羽，平均体重1．5kg±0．25kg（购自江西九江某种鸡场）。鸡只饲养环境相同，自由采食和饮水，16h光照。

1．2 试验药物及试剂 壳聚糖（水溶性，脱乙酰度90%，购自青岛云宙生化有限公司），氯化胆碱（含量：50%，购自南昌兽药店），复方中药（柴胡15g、黄芩9g、芍药9g、生姜15g、大黄6g等，购自江西农业大学校医院）。壳聚糖复方制剂的配制：中药浓缩至每1mL含生药0．5g的溶液，合并壳聚糖0．5g（壳聚糖的量按饲料的1%添加）混合配制，4℃冰箱保存（3d内用完）。天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT），乳酸脱氢酶（LDH）、脂蛋白酯酶（LPL）试剂盒由南京建成生化试剂厂生产。

1．3 饲料配方 对照组日粮参照美国NRC（1998）蛋鸡营养需要配合而成；试验组日粮除了能量、蛋白含量外，其他营养需要均参照美国NRC（1998）蛋鸡营养标准配合而成。配方及营养水平见表1（配方一：基础日粮；配方二：高能低蛋白日粮）。

表1 试验基础日粮构成

预混料配方：蛋鸡用多维299．10mg，铜4．95mg，铁31．30mg，锰41．21mg，锌42．04mg，碘0．61mg，硒0．15mg，沸石粉2465．28 mg，蛋氨酸997．01mg，杆菌钛锌39．93mg，抗氧喹164．5mg，胆碱448．65mg，糠3489．53mg

2 方法

2．1 蛋鸡脂肪肝综合征病理模型的建立 兽医临床上，一般对天门冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶、胆碱酯酶等肝脏特异性酶的检验来进行肝脏疾病诊断［2］。组织学上每单位面积有三分之一以上的肝细胞发生脂肪变性，亦可判定为脂肪肝。本试验采用高能低蛋白饲料饲喂，通过酶学诊断和病理切片来判定蛋鸡脂肪肝造模是否成功。鸡只适应环境1周后，将蛋鸡分为四组：A组饲喂基础日粮（配方一），B、C、D组饲喂高能低蛋白日粮（配方二），饲喂45d。

2．2 壳聚糖复方制剂对鸡脂肪肝综合征的疗效试验造模成功后，开始治疗试验。记录试验过程中各组鸡精神、发病和死亡情况。A组饲喂配方一日粮，B组继续饲喂配方二饲料；C组在饲喂配方二的基础上，饮水中添加壳聚糖复方制剂溶液2mL／只鸡；D组在饲喂配方二的基础上，添加氯化胆碱，剂量为2 g／kg饲料。在给药15d、30d取每组抽取6只鸡，颈静脉采血后剖杀，，取血液和肝脏匀浆测定生化指标，观察并记录各器官组织的肉眼变化。生化指标测定方法按照试剂盒说明书步骤严格规范执行。

2．3 血清样品采集 屠宰前禁食12h，心脏采血10mL，试管分装，先放入生化培养箱中1h，然后放入4℃冰箱3h，析出血清，离心分装于eppendorf管中，置－4℃ 冰箱保存。

2．4 匀浆制备 分别取同一部位肝脏样品30g左右，包于封口袋，液氮冷冻，置－80℃冰箱保存。切取部分肝脏，按1∶9的重量体积比加入生理盐水，匀浆后，于2 500r／min离心10min，取上清液测定。

2．5 病理学观察 将固定于10%福尔马林的组织块，于72h后取适宜大小肝脏做常规石蜡包埋，H．E．染色，光镜观察并记录病理组织学变化。

2．6 数据处理 数据均以（平均值X±标准误SE）形式表示，应用SPSS统计分析软件单因素方差分析组间差异显著性，进行各组间均数的多重比较。

3 结果

3．1 蛋鸡脂肪肝综合征病理模型的建立

3．1．1 酶学检测 试验第45天，A组与B组、C组、D组的ALT、AST活力差异显著（P＜0．05），B、C、D组ALT、AST活力明显升高，结合病理学变化，确定造模成功。

表3 高能低蛋白饲料对蛋鸡AST和ALT的影响

3．1．2 病理学观察 试验第45天，剖检鸡只，A组肝脏未见异常，色泽紫红，腹腔脂肪及肠系膜等处可见少量脂肪，B组、C组、D组肝脏肿大呈淡黄色或黄褐色，严重者肝脏破裂出血、质脆，用刀切时，刀面有脂滴附着，切面外翻，腹下、皮下、心包、胃及肠系膜均有大量脂肪沉积，胆囊肿大，胆汁充盈。从组织学变化来看，试验第45天，对照A组肝细胞大小、形状都比较正常，未见脂肪空泡、肿大变性现象，排列整齐，B、C、D三组肝细胞均有少量坏死，细胞肿大，胞核挤向一侧，且细胞内均有大小不一，数量不等的脂肪空泡，肝索和肝窦的结构不清晰。

3．2 壳聚糖复方制剂对鸡脂肪肝综合征的疗效试验

3．2．1 壳聚糖复方制剂对肝脏乳酸脱氢酶（LDH）活力的影响 给药15d，B组活力明显高于A组、C组、D组，差异均显著（P＜0．05），C组、D组活力差异不显著（P＞0．05）；给药30d，B组与 A组、C组、D组差异显著，说明随着治疗时间的延长，壳聚糖复方制剂对肝脏LDH活力的抑制作用更加明显。

表6 乳酸脱氢酶（LDH）活力 （U／L）

3．2．2 壳聚糖复方制剂对肝脏脂蛋白酯酶（LPL）活力的影响 给药15d，B组与C组、D组差异显著（P＜0．05），添加壳聚糖复方制剂后，C组LPL活力显著升高。给药30d，B组与C组差异显著（P＜0．05），与健康A组差异不显著（P＞0．05），并且壳聚糖复方制剂治疗效果优于氯化胆碱。A组活力降低，这可能与温度增高，鸡对能量的需求少，脂肪分解减少，便造成机体脂肪沉积。

表7 脂蛋白酯酶（LPL）活力 （U／L）

3．2．3 病理学观察 试验结束时，B组肝脏呈土黄色且有明显出血点，有些地方出现凝血块，其他症状与第45天相似。C组和D组在给药30d，与同期B组相比，明显红润，外观基本正常。组织学观察到，给药30d后，对照A组肝脏出现了少量空泡，且整个结构不呈正常的放射状排列，说明在高温季节，日粮沉积也可造成一定程度肝变性，脂质含量增多。B组细胞间界限消失，整个视野下只见脂肪空泡，脂肪颗粒弥漫性浸润，肝细胞边缘只有少量细胞质，肝细胞索和肝窦结构消失，整个肝脏成网状结构。C组和D组肝脏未见肝细胞空泡，肝细胞大小、形状、排列及肝窦大小均表现正常，与第45天时相比，肝细胞变性程度明显减轻。

4 讨论

4．1 蛋鸡脂肪肝综合征病理模型的建立 当肝脂逐渐增加时，肝细胞机能降低，细胞膜破坏受损，致使高能低蛋白饲料的能量不能正常转化，甘油三酯在肝脏蓄积，肝脏受损，高产期的蛋鸡合成鸡蛋时，加重肝脏的代谢功能，肝脏超负荷工作，也是造成肝脏受损变性的原因之一［3］。本试验中，第45天，B、C、D组ALT、AST活力明显高于A组。显微镜下观察脂肪滴充满细胞致使肝细胞肿大变性，界限模糊，低倍镜下每个视野有三分之一的肝细胞发生脂肪变性或中倍镜下每个视野有二分之一的肝细胞发生脂肪变性。曹华斌［4］等均采用高脂饲料喂饲试验动物，与空白对照组相比，脂肪肝模型组肝指数、脂质含量均高于空白对照组。表明高能低蛋白饲料能成功建立动物脂肪肝模型。

4．2 壳聚糖复方制剂对鸡脂肪肝综合征的疗效试验

Ormrod等［5］对缺乏载脂蛋白E的动脉粥样硬化小鼠饲喂含有5%食用壳聚糖的饲料20周后，发现壳聚糖能显著降低血清胆固醇。壳聚糖对脂肪肝的作用机理可能与其正电性有关，正电性的壳聚糖和负电性的胆汁酸结合排出体外，脂肪不被乳化，影响脂肪的消化吸收，降低血清甘油三酯含量，同时由于壳聚糖与胆汁酸结合排出体外，重新吸收入肝脏中的胆汁减少胆囊排空，而胆囊中必须有一定量的胆汁酸储备，这就促进肝脏将胆固醇转化成胆汁酸，使血液胆固醇含量降低［6］；碱性的壳聚糖在胃中能与胃酸作用形成凝胶，在肠内pH值条件下可以保持该凝胶不分解，且具有吸附胆汁酸和胆固醇的作用。吸附了胆汁酸和胆固醇的壳聚糖凝胶随着粪便排出体外，从而降低了血中的脂肪和胆固醇，减少了脂肪的吸收，因而降低了血清总胆固醇和甘油三酯的水平［7］。

中药柴胡皂苷可以有效地稳定肝细胞膜系统，具有镇静止痛，解热，抗病毒，抗炎，抗癌，降血脂，保肝，提高免疫力的作用。黄芩化学成分主要含有黄酮类成分，具有抗氧化功能，清除机体由于受损或衰老产生的自由基，对肝脏和心血管都有保护作用。大黄可以排除微循环障碍，恢复组织细胞的代谢功能及血液的供应，增强肝细胞再生能力。Ahmed和Fuhrman均发现，生姜可以调节大鼠脂质过氧化和氧化度，降低体内脂质过氧化物［8］。其机理可能与上述药物在降脂同时，兼以保肝、改善微循环、减轻脂质过氧化等，从不同的环节作用于肝脏而产生的互补作用有关。本试验表明，壳聚糖复方制剂可明显降低LPL活性，LDH活力升高，减轻了肝脏的炎性损伤和脂肪变性程度。综上所述，通过添加壳聚糖复方制剂，对动物脂肪肝有一定的治疗效果。

［1］ 曹小菊．中医对脂肪肝的认识及治疗现状［J］．中医杂志，2000，41（6）：373－375．

［2］ Pappo I，Bercover H，Berry，etal．Anti－tumor necrosis factor antibodies reduce hepaticstreatosis during total parenteral nutrition and bowel rest in the rat［J］．JPEN J Parenter E nteral Nutr，1995，19：80．

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［4］ 曹华斌，胡国良，郭小泉，等．高能低蛋白日粮饲养蛋鸡肝脏脂肪沉积及其组织病理学观察［J］．中国兽医学报，2010，30（7）：1009－1012．

［5］ Ormrod D J，Holmes C C，Miller T E．Dietary chitosan inhibits hypercholesterolaemia and aterogene－sis in the apolipoprotein E－deficient mouse model of atherosclerosis［J］．Atherosclerosis，1998，138（2）：329－334．

［6］ Thongngam M，Mclements D J，etal．Characterization of interactions between chitosan and an anionic surfactant［J］．Agric Food Chem，2004，52（4）：987－991．

［7］ 来水利，王克玲．壳聚糖及其衍生物的降血脂作用机理［J］．日用化学品科学，2008，31（10）：30－32．

［8］ Fuhrman B，Rosenbat M，Hayek T，etal．Ginger extract consumption reduces plasma cholesterol，inhibits LDL oxidation and attenuates development of atherosclerosis in atherosclerotic，apolipopro－tein E deficient mice［J］．J Nutr，2000，130（5）：1124－1131．