周雄川，李冬生，陈 雄*，王 志

（湖北工业大学 生物工程学院，发酵工程教育部重点实验室，工业发酵湖北省协同创新中心，湖北 武汉 430068）

酱油酿造中制曲菌株主要是米曲霉（Aspergillusoryzae），而米曲霉的主要酶系为蛋白酶和淀粉酶，并且这2种酶的酶活较高[1]；另有纤维素降解酶[1-2]和谷氨酰胺酶。酱油酿造过程中主要用到的原料是大豆、豆粕、麸皮和面粉，其中豆粕蛋白质含量高，脂肪含量低，水分也少，容易粉碎，价格低廉，是酱油酿造的理想原料[3-4]。麸皮是小麦制粉时的副产品，麸皮质地疏松，表面积大，但比重小，且含粗蛋白质9.4%～17.5%，粗脂肪1.7%～5.6%，还含有多种维生素及钙、铁等无机盐，营养成分适于促进米曲霉生长及其产酶[5]。酱油酿造需极强的蛋白酶活力，为使大豆蛋白酶从组织中充分裸露，又需借助植物崩裂酶活力（果胶酶、半纤维素酶、纤维素酶等）[6]。蛋白酶包括酸性蛋白酶，中性蛋白酶和碱性蛋白酶，其中中性蛋白酶酶活较高[7-8]。纤维素降解酶是一个多组分酶系，通常包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶[9-11]。内切葡聚糖酶作用于纤维素分子内部的非晶体区或羧甲基纤维素，随机水解β-1，4-糖苷键，将长链纤维分子截断，产生大量小分子纤维素，因此，内切葡聚糖酶是提高酱油的膳食纤维含量的一个关键酶。内切葡聚糖酶可以降解大分子不溶性膳食纤维为可溶性膳食纤维，提高酱油中可溶性膳食纤维的含量，因此，提高米曲霉在制曲过程中蛋白酶和内切葡聚糖酶的活力对于酱油酿造具有十分重要的意义。

本研究以提高米曲霉Y6菌株产中性蛋白酶和内切葡聚糖酶的活力为目的，以豆粕和麸皮为原料，通过单因素试验和正交试验来确定最佳发酵工艺条件，为高膳食纤维风味酱油酿造制曲工艺的改进提供实验基础和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

米曲霉（Aspergillus oryzae）Y6，为本实验室保藏。

1.1.2 培养基

固体培养基：豆粕和麸皮质量比为7∶3再加一定量的水。

1.1.3 化学试剂

干酪素（化学纯）：北京鼎生物技术有限责任公司；Folin-酚、三氯乙酸、碳酸钠、羧甲基纤维素钠：国药集团化学试剂有限公司；3，5-二硝基水杨酸：武汉市华顺生物有限公司。

1.2 仪器与设备

AL204电子天平：奥豪斯国际贸易（上海）有限公司；LRH-250生化恒温培养箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；722型-分光光度计：上海精密仪器有限公司；HS30A恒温水浴摇床：中国科学院武汉科学仪器厂；JXY4-H8数显恒温水浴锅：国华电器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酶活的定义

中性蛋白酶活的定义：1g固态发酵产物在40℃、pH 7.2条件下，1min分解酪蛋白产生1μg酪氨酸，定义为一个酶活单位，U/g。

内切葡聚糖酶活的定义：1g固态发酵产物在40℃、pH 5.5条件下，1min分解羧甲基纤维素钠产生1μg葡萄糖，定义为一个酶活单位，U/g。

1.3.2 酶活的测定方法

中性蛋白酶酶活采用福林-酚方法测定[12]。内切葡聚糖酶活按参考文献[13]的方法测定。

1.3.3 米曲霉工艺优化试验

利用单因素试验，在不同温度、接种量、含水量和发酵时间的工艺条件下，对米曲霉Y6产中性蛋白酶、内切葡聚糖酶的活力进行检测，初步确定菌株产酶较适合的温度、接种量、含水量和发酵时间。在此基础上，利用L9（34）正交试验设计确定米曲霉Y6最佳制曲工艺。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验结果

2.1.1 不同接种量对酶活力的影响

接种量对微生物生长的延迟期有一定的影响，一般来讲，接种量越大，延迟期越短，有利于微生物生长和代谢产物积累[14]，但米曲霉产酶部位是菌丝，接种量太多不利于米曲霉的菌丝的生长，也不利于产酶。

图1 接种量对中性蛋白酶活力的影响Fig.1 Effect of inoculum on neutral protease activity

由图1可知，接种量对米曲霉产酶有一定影响，接种量为1.0×107个孢子/g干基时，中性蛋白酶活力最高，其达到2837U/g；接种量为0.5×107个孢子/g干基时，中性蛋白酶活力为2635U/g；接种量分别为1.5×107个孢子/g干基和2.0×107个孢子/g干基时，中性蛋白酶活力分别达到2348U/g和2174U/g。因此，中性蛋白酶的最佳接种量为1.0×107个孢子/g干基。

图2 接种量对内切葡聚糖酶活力的影响Fig.2 Effect of inoculum on endoglucanase activity

由图2可知，接种量为0.25×107个孢子/g干基时，内切葡聚糖酶的酶活为658U/g；接种量为0.5×107个孢子/g干基时，内切葡聚糖酶活力最高，其为683U/g；当接种量分别增加到0.75×107个孢子/g干基和1.0×107个孢子/g干基时，内切葡聚糖酶活力分别下降为623U/g和602U/g，因此，内切葡聚糖酶的最佳接种量为0.5×107个孢子/g干基。

2.1.2 不同温度对酶活力的影响

温度是微生物生长和代谢的重要条件，温度也是保证米曲霉产酶的重要条件。温度过低或过高都不利于菌体的生长和产酶。因此，在发酵过程中必须保证合适而稳定的温度环境[15]。

图3 温度对中性蛋白酶活力的影响Fig.3 Effect of temperature on neutral protease activity

由图3可知，中性蛋白酶的最适发酵温度为30℃时，蛋白酶活力最高，达到了3051U/g，温度高于32℃或低于28℃米曲霉的中性蛋白酶活力都会下降。

由图4可知，在30℃时，米曲霉Y6发酵产物的内切葡聚糖酶活力为703U/g，随着温度升高为32℃时，内切葡聚糖酶的活力下降到674U/g，而温度降低为28℃时内切葡聚糖酶的活力仅为613U/g。因此，内切葡聚糖酶的最适发酵温度为30℃。

图4 温度对内切葡聚糖酶活力的影响Fig.4 Effect of temperature on endoglucanase activity

2.1.3 不同含水量对酶活力的影响

固体发酵培养基的含水量在整个发酵过程中起关键性作用。一方面，含水量影响到微生物生长所要求的渗透压；另一方面，含水量对微生物生长和产酶的影响还由于其可改变固体颗粒的物理性质，过高的含水量会改变豆粕和麸皮颗粒之间的松散性，使豆粕和麸皮成团，影响到氧气的传递和发酵热的散失，导致酶活力下降，而含水量过低则会影响到营养物质的溶解和传递以及颗粒的润胀等条件，限制微生物对营养物质的利用[16]。

图5 含水量对中性蛋白酶活力的影响Fig.5 Effect of moisture on neutral protease activity

由图5可知，含水量为70%时，中性蛋白酶的活力为2831U/g；含水量为80%时，酶活为3236U/g；随着含水量分别增加至90%和100%，中性蛋白酶活力分别下降至2748U/g和2457U/g。因此，可以得出中性蛋白酶最佳发酵的含水量为80%。

由图6可知，含水量对内切葡聚糖酶的活力有比较大的影响，在一定的范围里，随着含水量的不断增加，内切葡聚糖酶的活力在不断增加，在含水量为80%时，内切葡聚糖酶的活力为447U/g；当含水量上升为100%时，内切葡聚糖酶的活力为736U/g，增加了64.7%；但当含水量继续增加为110%，内切葡聚糖酶的酶活又降低至652U/g，因此内切葡聚糖酶的最佳发酵含水量为100%。

图6 含水量对内切葡聚糖酶活力的影响Fig.6 Effect of moisture on endoglucanase activity

2.1.4 不同培养时间对酶活力的影响

培养时间对于米曲霉产酶有比较大的影响，米曲霉的孢子在营养充足的条件下发芽繁殖生成菌丝体，米曲霉的各种酶系是由菌丝体代谢产生，因此，在这个时期米曲霉的产酶能力很强，而随着时间的延续，米曲霉繁殖到一定的程度后，由于温度、湿度、营养物质的限制，米曲霉的菌丝又开始产生孢子，这个时期又不利于产酶。

图7 培养时间对中性蛋白酶活力的影响Fig.7 Effect of culture time on neutral protease activity

由图7可知，米曲霉在不同的培养时间段中性蛋白酶活力存在明显的差异，在36h时酶活最低，只有2369U/g，而在42h时酶活到达最高，为3252U/g，48h和54h时的酶活分别为2754U/g和2538U/g，因此，米曲霉产中性蛋白酶的最佳时间为42h。

图8 培养时间对内切葡聚糖酶活力的影响Fig.8 Effect of culture time on endoglucanase activity

由图8可知，不同的培养时间对米曲霉产内切葡聚糖酶有比较显著的影响，在一定的范围里，随着时间的延长，内切葡聚糖酶活力不断增加，在36h的酶活为512U/g，48h时的酶活为646U/g，60h的酶活为740U/g，但当培养时间继续延长为72h时，酶活又下降到652U/g，因此，米曲霉产内切葡聚糖解酶的最佳时间为60h。

2.2 发酵条件优化正交试验结果

依据单因素试验和酱油的酿造工艺条件，选择温度、接种量、培养时间和含水量4个因素，按表1和表2所示因素水平，在豆粕和麸皮培养基中进行固态发酵实验，以发酵产物中的中性蛋白酶，内切葡聚糖酶的活力为评价指标来确定最佳发酵条件，正交试验结果分别见表3及表4。

表1 米曲霉产中性蛋白酶发酵条件优化正交试验与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for optimization of neutral protease production byAspergillus oryzae

表2 米曲霉产内切葡聚糖酶发酵条件优化正交试验与水平Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments for optimization of endoglucanase production byAspergillus oryzae

表3 米曲霉产中性蛋白酶发酵条件优化正交试验结果与分析Table 3 Results and analysis of orthogonalexperiments for optimization of neutral protease production byAspergillus oryzae

由表3可知，培养时间对固态发酵产物中的中性蛋白酶的酶活影响最大，其次为接种量，温度的影响最小。菌株最佳发酵参数为2号组合（A2B2C2D2），即温度为28℃，接种量1.0×107个孢子/g干基，培养时间42h，含水量80%，在此条件下，中性蛋白酶活力达到3254U/g。由极差分析得到的菌株最佳发酵参数组合为A2B2C2D2，由于试验得到的最优发酵条件未包含在正交试验设计表的9组试验中，为进一步确定实验结果，按温度30℃，接种量1.0×107个孢子/g干基，培养时间42h，含水量80%，做了3次平行试验，中性蛋白酶酶活平均值为3637U/g，因此得到米曲霉产中性蛋白酶的最佳发酵工艺为温度30℃，接种量1.0×107个孢子/g干基，培养时间42h，含水量80%。

表4 米曲霉产内切葡聚糖酶发酵条件优化正交试验结果与分析Table 4 Results and analysis of orthogonalexperiments for optimization of endoglucanase production byAspergillus oryzae

由表4可知，含水量对固态发酵产物中内切葡聚糖酶的酶活影响最大，其次为培养时间，温度的影响最小。菌株最佳发酵参数为4号组合（E2F1G2H3），即温度为30℃，接种量0.25×107个孢子/g干基，培养时间48h，含水量110%，在此条件下，内切葡聚糖酶活力达到734U/g。由极差分析得到的菌株最佳发酵参数为E2F1G2H2，由试验得到的最优发酵条件未包含在正交试验设计表的9组试验中，为进一步确定试验结果，按温度30℃，接种量0.25×107个孢子/g干基，培养时间48h，含水量100%，做了3次平行试验，内切葡聚糖酶酶活平均值为810U/g，因此得到米曲霉产内切葡聚糖酶的最佳发酵工艺为温度为30℃，接种量0.25×107个孢子/g干基，培养时间48h，含水量100%。

3 结论

对米曲霉菌株以豆粕和麸皮为培养基的制曲工艺进行了研究，正交试验结果显示米曲霉产中性蛋白酶的最佳制曲工艺为温度30℃，接种量1.0×107个孢子/g干基，培养时间42h，含水量80%，而产内切葡聚糖酶的最佳制曲工艺为温度为30℃，接种量0.25×107个孢子/g干基，培养时间48h，含水量100%。该制曲工艺可以用来指导高膳食纤维风味酱油的酿造，在高膳食纤维酱油酿造制曲过程中可以适当的控制蛋白酶活力不降低的情况下来提高内切葡聚糖酶的活力，从而可以提高酱油中膳食纤维含量。

综上所述，米曲霉Y6能产多种酶类，对于提高酱油的原料的利用率以及提高酱油的可溶性膳食纤维含量具有十分重要的作用。

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