吴慧玲，董盛宇，叶耀耀，周 慧

1.吴川市人民医院五官科(广东 吴川524500)

2.广东医学院附属医院耳鼻咽喉科(广东湛江524000)

鼻咽癌患者，尤其是颈部淋巴结有转移的患者通常的治疗方案为放疗的同时进行药物化疗。鼻咽癌常规化疗药物紫杉醇(Paclitaxel)的副反应有呕吐、骨髓抑制、过敏反应等。为减轻化疗后的副作用，改善患者的临床症状，常与糖皮质激素如地塞米松(dexamethasone，DEX)联合使用。然而在临床治疗过程中发现，肿瘤细胞会对化疗药物丧失敏感性。有报道显示，这种脱敏效应与DEX的使用有关，DEX能降低肿瘤细胞对抗癌化疗药物的敏感性，导致癌细胞内凋亡基因表达减少，并且抗凋亡蛋白基因量的表达增加，使得化疗后肿瘤细胞的存活率明显增高［1－2］。人参皂苷 Rh2(ginsenoside Rh2，GSRh2)可以有效的增进淋巴因子IL－12等的活性，提高免疫功能，同时能提升细胞对化学药物的耐受性，减少副作用，增强化疗效果［3］。联合使用药物时如何在减轻副反应和提高化疗效果上取得平衡，一直是临床医生关注的问题。因此，本实验拟观察化疗药Paclitaxel联合DEX和人参皂苷Rh2处理鼻咽癌细胞CNE－2Z，通过对细胞生长、凋亡的检测，探讨DEX的使用对鼻咽癌细胞接受Paclitaxel治疗时的影响及Rh2在上述影响中的作用。为临床治疗鼻咽癌时的药物选择摸索规律。

1 材料与方法

1.1 人鼻咽癌细胞的培养 鼻咽癌细胞株CNE－2Z由广东医学院病理学教研室提供。CNE－2Z于10%小牛血清的RPMI－1640培养液中常规培养。培养液中含100 U/ml青霉素和100 mg/L链霉素，pH 值为 7.2－7.4，在 37℃、5%CO2的培养箱中培养。

1.2 MTT法检测细胞的生长情况 将CNE－2Z细胞接种至96孔板，接种密度为1×104/ml，接种后观察细胞生长情况，当融合度到达80%左右时即可进行实验。实验分为空白对照组、单纯紫杉醇组(Paclitaxel，CAS:33029624，Acros 公司，2 μM)，DEX(Cat:100129，Sigma 公司，1 μM)，预处理组(DEX+Paclitaxel)、联合用药组(DEX+Paclitaxel+GSRh2)，人参皂苷GSRh2浓度为20μg/ml(浙江亚克药业公司)。给药顺序为DEX作用2 h后再向细胞培养液中加入紫杉醇或者紫杉醇和人参皂苷。作用一段时间后，加入MTT，通过酶标仪测量每组的OD值。利用下列公式计算各组的抑制率。Inhibited rate(%)=(1－ODt/ODctr)×100%，其中 ODt为处理组570 nm的平均OD值，ODctrl为对照组570 nm的平均OD值。

1.3 RT－PCR检测目的基因 mRNA 利用TRIzol提取各实验组细胞的总RNA，采用QIAGEN公司的一步法试剂盒(OneStep RT－PCR Kit)，对目的基因CASPASE－12，CyclinD1进行逆转录及扩增，然后电泳拍照，软件Bandscan 5.0分析电泳图片，计算目的基因和内参GAPDH的比值作半定量分析。见表1。

表1 目的基因设计的引物序列

1.4 数据处理 采用 SigmaPlot 10.0软件作图，SPSS13.0统计学软件分析实验数据。MTT细胞抑制率试验A570nm的OD值以Mean±SD表示，组间比较采用方差检验。

2 结果

2.1 Paclitaxel、DEX以及 GSRh2联合作用对鼻咽癌细胞增殖的影响 单纯使用紫杉醇能显著抑制CNE－2Z细胞的增殖，而预先用DEX处理过的肿瘤细胞，紫杉醇对其抑制效应明显受到了抑制，紫杉醇作用48h后细胞的抑制率由单纯处理时的(45.8±2.4)%下降到(30.5±2.1)%，说明 DEX 预处理会导致鼻咽癌细胞对Paclitaxel的敏感性部分丢失。而在DEX预处理基础上，联合人参皂苷和紫杉醇作用在肿瘤细胞后，与对照组相比，细胞增殖的抑制现象明显出现缓解，其抑制率恢复到(40.00±1.1)%。见表2。

表2 各处理因素对CNE－2Z细胞增殖的抑制作用(OD value，±s，n=3)

表2 各处理因素对CNE－2Z细胞增殖的抑制作用(OD value，±s，n=3)

注:*P＜0.05 vs Paclitaxel

Group OD(24h) OD(48h)Inhibition%(48h)Control 0.79±0.02 0.82±0.05－Paclitaxel 0.58±0.06 0.44±0.07 45.80±2.40 DEX+Paclitaxel0.64±0.14 0.57±0.06 30.50±2.10*Paclitaxel+DEX+GSRh2 0.61±0.05 0.49±0.06 40.00±1.10*

Paclitaxel作用于细胞24h和48h后，细胞生长明显受到抑制，与对照组相比差异明显(P＜0.05)，预先使用DEX后，细胞生长抑制率明显降低，与单纯Paclitaxel组相比P＜0.05，表明大量的肿瘤细胞在Paclitaxel和DEX的联合处理后仍旧存活。加入人参皂苷Rh2后，同无Rh2组相比，细胞的生长抑制率再次升高，表明人参皂苷恢复了部分肿瘤细胞对Paclitaxel的敏感性。见图1。

2.2 联合用药后鼻咽癌细胞cyclinD1和caspase－12基因表达的检测 鼻咽癌细胞CNE－2Z经Pacli-taxel作用后，与对照组相比其Cyclin D1的表达明显下调说明肿瘤细胞增殖能力受到抑制，而凋亡基因Caspase－12的表达则明显上调，表明细胞被Paclitaxel诱导出现凋亡。DEX预处理后，由Paclitaxel诱导出的cyclinD1下调和Caspase－12的上调作用明显被抑制。而人参皂苷的加入则部分逆转了DEX的这种效应，恢复了细胞对Paclitaxel的敏感性。

图1 Paclitaxel和DEX对鼻咽癌细胞CNE－2Z增殖的影响

与对照组比，单纯Paclitaxel组显著抑制了鼻咽癌细胞CyclinD1的表达(条带2)，而DEX的作用使得CyclinD1的表达上调(条带3)，人参皂苷的作用则再次下调了CyclinD1的表达(条带4)。见图2。

图 2 Paclitaxel、DEX 和 GSRh2对Cyclin D1 mRNA表达的影响

与对照组比，单纯Paclitaxel组显著提高了鼻咽癌细胞Caspase－12的表达(条带2)，而DEX的作用使得Caspase－12的表达下调(条带3)，人参皂苷的作用则再次上调了 Caspase－12的表达(条带4)。见图3。

利用bandscan5.0软件扫描，以内参作半定量分析，可见单纯Paclitaxel能显著抑制鼻咽癌细胞cyclin D1的表达，同时能显著增强Caspase－12的表达(P＜0.05)，从而实现肿瘤细胞增殖的抑制以及凋亡的诱导。而DEX预处理组，DEX能干扰Paclitaxel对鼻咽癌细胞的这种效应，在此基础上如果使用了GSRh2，cyclinD1的表达再次下调，caspase－12的表达再次上调，表明其能部分恢复Paclitaxel对肿瘤细胞的杀伤效应。见图4。

图 3 Paclitaxel、DEX 和 GSRh2对 Caspase－12 mRNA表达的影响

图4 Paclitaxel、DEX和GSRh2对鼻咽癌细胞cyclin D1和Caspase表达的影响

3 讨论

鼻咽癌患者通常只有在以下情况下会接受化疗药物的治疗，①对放疗不敏感;②有远处转移。化疗药物在使用时往往会伴随一些副反应，而糖皮质激素如DEX可以起到部分缓解作用，因而被广泛的使用在癌症患者的化疗方案中。但是有研究表明在非小细胞肺癌接受顺铂联合DEX处理后，DEX能降低顺铂诱导细胞凋亡的效果，导致肿瘤细胞的存活率显著上升［4－6］。这一结果提示在解决化疗药物副反应的问题上，激素的使用应当谨慎。

本实验首先观察DEX对Paclitaxel诱导的肿瘤细胞凋亡是否有影响，我们通过MTT法测得细胞抑制率来反应细胞存活情况。由实验结果可知单纯Paclitaxel组对肿瘤细胞的生长表现出明显的抑制，在使用DEX后，肿瘤细胞不能很好的被Paclitaxel杀死，存活率明显升高。该结果与文献报道一致［2－6］，很显然这不利于鼻咽癌患者的预后。

为探寻DEX降低鼻咽癌细胞对Paclitaxel敏感性的机制，本实验以原癌基因和凋亡基因为切入点，观察了Cyclin D1和Caspase－12的表达情况。Cyclin D1为G1期细胞周期蛋白能够驱动细胞由G1期进入S期，促进细胞增殖。因而当Cyclin D1表达失控时，可能导致细胞增殖周期失调，从而产生肿瘤［7］。实验中我们发现鼻咽癌细胞CNE－2Z高表达Cyclin D1，而Paclitaxel处理后则显著降低了Cyclin D1的表达，因此推测Paclitaxel是通过影响细胞DNA损伤有关的信号通路关键点Cyclin D1的下调，使得鼻咽癌细胞的周期被阻滞在G1期，无法进入S期，导致细胞不能增殖，转而出现凋亡，从而达到减少肿瘤细胞数量的目的，发挥治疗效果［8］。Caspase－12 是典型的凋亡基因［6，9］，在我们实验中发现鼻咽癌细胞CNE－2Z的表达很低，而使用了Paclitaxel后Caspase－12的表达显著升高，我们推测Paclitaxel是通过Caspase－12激活细胞凋亡的有关信号通路(如凋亡相关信号通路NF－kB)，从而诱导细胞凋亡，减少肿瘤细胞数量。DEX降低了鼻咽癌细胞对Paclitaxel的敏感性，说明DEX使得鼻咽癌细胞对Paclitaxel诱导出的凋亡效应减弱了，导致肿瘤细胞大量存活，肿瘤细胞对Paclitaxel敏感性降低。

人参皂苷Rh2可以作为肿瘤耐药逆转剂提高化疗药物的抗肿瘤活性。一般的化疗药物不易进入癌细胞，癌细胞中有种P－糖蛋白可将化疗药物排出，造成癌细胞对化疗药物产生耐受性，Rh2具有亲水及亲油的特性，可以轻易进入细胞核内而杀死癌细胞。尤其和传统的化疗药物联合应用时效果更好。当剂量为15.0 mg/L的人参皂苷Rh2与0.4 mg/L的顺铂(DDP)联合使用时 ，对癌细胞的抑制率与十倍剂量DDP(4.0mg/L)的抑癌效果相同，说明人参皂苷Rh2能大大提高肿瘤细胞对DDP的敏感性［10］。其机理主要是二者通过不同途径诱导肿瘤细胞凋亡，产生协同作用从而提高了低剂量DDP诱导细胞凋亡的能力。我们实验结果也表明人参皂苷Rh2与紫杉醇(Paclitaxel)合用的情况下，即使预先使用了DEX，肿瘤细胞CNE－2Z的增殖依然是受到了明显的抑制。

以上结果表明，在临床治疗鼻咽癌时，需要使用DEX预防化疗药物的副作用，应当谨慎的选择激素药物的剂量，同时可以通过人参皂苷Rh2的使用，减少化疗药的剂量，减轻患者的副反应，从而减少激素的使用剂量，使治疗效果更加理想。

［1］Meschini S，Marra M，Calcabrini A.Role of he lung resistance－related protein(LRP)in the drug sensitivity of cultured tumor cell［J］.Toxicol in vitro，2002，16(4):389－398.

［2］Gassler N，Zhang C，Wenger T，et al.Dexamethasone－induced cisplatin and gemcitabine resistance in lung carcinoma samples treated ex vivo［J］.Br J Cancer，2005，92(6):1084－1088.

［3］朱君荣，孙建国，谢海棠，等.人参皂苷Rh2对人乳腺癌T47D细胞的省略长抑制作用及对Caspase－3表达的影响［J］.中国临床药理学与治疗学，2007，12(6):630－634.

［4］尹满香，张成文，杨勇，等.地塞米松对紫杉醇诱导中国人肺腺癌原代细胞凋亡的影响［J］.中国肺癌杂志，2010，13(1):28－33.

［5］Chen YX，Wang Y，Fu CC，et al.Dexamethasone enhances cell resistance to chemotherapy by increasing adhesion to extracellular matrix in human ovarian cancer cells［J］.Endocr relat.Cancer，2010，17(1):39－50.

［6］Haiyan Ge，Songshi Ni，Xingan Wang，et al.Dexamethasone Reduces Sensitivity to Cisplatin by Blunting Caspase－12－Dependent Cellular Senescence in Non－Small Cell Lung Cancer［J］.PLOS ONE，2012，7(12):e51821.

［7］Niida H，Nakanishi M.DNA damage checkpoints in mammals［J］.Mutagenesis，2006，21(1):3－9.

［8］贺建宇，李士英，徐卫明，等.多西他赛联合奥沙利铂联合紫杉醇对晚期非小细胞肺癌化疗的临床研究［J］.同济大学学报(医学版)，2010，31(6):83－88.

［9］刘特，黄文彬，赖冬梅，等.姜黄素对人脑胶质瘤细胞凋亡作用及其对Bcl－2与Caspase8诱导表达的影响［J］.2009，19(4):247－251.

［10］冯晓娜，蒋革，李清.人参皂苷Rh2提高人乳腺癌细胞MCF7对5氟尿嘧啶诱导凋亡的敏感性［J］.沈阳药科大学学报，2012，29(5):383－386.