谭 刚，王家瑞

1.湖北民族学院医学院人体解剖学教研室(湖北 恩施445000)

2.重庆三峡中心医院急救分院外二科(重庆 万州404000)

尾型同源盒基因－2(caudal－related homeobox gene 2，CDX2)属于同源盒基因家族中的一员，是肠道特异性转录因子。MLODZIK最早在果蝇中分离成功CDX2基因及其相关蛋白，与Parahox家族有高度的同源性［1］。国内外实验已证明 CDX2在肠道上皮化生方面表现出具有诱导细胞向肠上皮分化的作用［2－3］。目前的研究表明结直肠癌发生过程中CDX2的表达下调能引起增殖增加和分化丢失，CDX2基因与其他多基因共同参与结直肠癌的发生发展［4］。我们通过预实验检测过人直肠癌细胞XB1847系中未有CDX2表达，本实验通过构建携带人CDX2基因慢病毒表达载体，转染人直肠癌细胞XB1847系，为在体外进一步探讨CDX2基因在直肠癌中的作用提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料 大肠杆菌菌株DH5和包装细胞人胚胎肾上皮细胞293T由本实验室保存。慢病毒载体购自美国Clontech公司，带有人全长CDX2 cDNA质粒pOTB7和人直肠癌细胞XB1847均购于上海博耀生物科技有限公司，各种DNA限制性内切酶、T4连接酶、高保真TaqDNA聚合酶等以及引物合成及测序由上海生工完成，转染试剂LipofectamineTM 200脂质体购自美国Invitrogen公司，CDX2和GAPDH兔抗人一抗购自Santa Cruz公司，红外荧光染料标记的驴抗兔二抗购自美国LI－COR公司。其余如胎牛血清试剂，空载病毒液试剂均为国产或者进口分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 引物设计及 PCR扩增 CDX2基因 根据Gene Bank上人CDX2序列，用primer5软件设计上下游引物(命名为全长引物)为:CDX2－FW:5'GACCCTCGCCACCATGTAC3'，CDX2－RV:5'CATGGCTCAGCCTGGAATTG3'，扩增出981 bp。在上、下游引物的5'端分别加上PmeⅠ酶切位点及其保护碱基成为酶切引物，序列如下:5'GGGTTTAAACCCGACCCT CGCCACCATGTACG3'，和 5'GGGTTTAAACCCCATG GCTCAGCCTGGAATTG3'，扩增CDX2的编码序列，共1005bp。以CDX2 cDNA质粒pOTB7为模板，使用酶切引物和Tap高保真酶进行PCR扩增，反应体系为25μl，反应参数为 94℃ 5 min;94℃ 30 s，58℃30s，72℃ 30 s，30 个循环;72℃10 min;4℃ 保存。PCR产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳(以下凝胶浓度相同)。

1.2.2 重组载体质粒的构建及鉴定 用DNA凝胶试剂盒对CDX2基因纯化回收，PmeⅠ进行酶切，再次纯化回收;PmeⅠ酶切pWPI载体质粒后去磷酸化处理，DNA凝胶试剂盒纯化回收。将具有相同酶切平末端的线性pWPI载体和CDX2基因在T4连接酶的作用下进行连接，获得重组载体质粒，命名为pWPI－CDX2。转化感受态细菌DH5a，筛选培养后随机挑取单个菌落，过夜培养，提取质粒。以提取的质粒为模板，分别进行PmeⅠ酶切和用CDX2基因全长引物行PCR扩增初步鉴定。将PCR鉴定正确的质粒送上海生工测序。

1.2.3 慢病毒的包装并感染XB1847细胞 将测序正确的pWPI－CDX2扩繁并提取质粒备用。六孔板中每孔接种约 1.5×106个 293T细胞，各加 2 ml DMEM完全培养基，37℃，5%CO2(以下培养条件相同)培养过夜，取20μl脂质体LipofectamineTM 2000和慢病毒系统三质粒pWPI－CDX2载体质粒12.7μg+pCMV－dR8.74 包膜质粒 2.3 μg+pMD2.G 包装质粒 1.6 μg(实验组)，按照脂质体 LipofectamineTM 2000说明进行操作，转染至293T细胞中，同时转染pWPI+pCMV－dR8.74+pMD2.G 进另一组293T 细胞作为空载体(对照组)，转染36h后在荧光显微镜下观察绿色荧光。在转染后36 h～48 h期间收集六孔板中含有病毒的细胞培养液，4℃ 5000 g离心10 min，小心吸取上清液分装后立即放置－80℃保存。将XB1847传代培养后按每孔4×105个细胞接种于24孔板中，培养过夜，冰上解冻病毒液，取600 μl滴入培养XB1847细胞的24孔板中，DMEM完全培养基培养24h后更换含胎牛血清的培养基，继续培养至60h后在荧光显微镜下观察。同样方法将空载体的病毒液感染另一组XB1847细胞作为对照组。

1.2.4 慢病毒表达载体的鉴定

1.2.4.1 PCR 检测 CDX2基因表达 将 pWPICDX2慢病毒载体质粒感染的XB1847细胞和对照组，提取细胞的总RNA，逆转录为cDNA，其反应体系为 20 μl，反应参数为 30℃ 10 min，42℃ 60 min，95℃ 5min，4℃保存，然后以CDX2基因全长引物分别进行PCR扩增，反应条件同前。

1.2.4.2 Western Blot检测 CDX2 蛋白表达 将pWPI－CDX2慢病毒载体质粒感染的XB1847细胞和对照组提取细胞总蛋白，煮沸变性后行SDSPAGE电泳分离蛋白(5%浓缩胶，12%分离胶)，半干法转移至PVDF膜上，常温下5%脱脂牛奶封闭2 h，兔抗人 CDX2多克隆抗体(1∶1000)和兔抗人GAPDH多克隆抗体(1∶1500)4℃过夜孵育，红外荧光染料标记的驴抗兔二抗(1∶5000)避光作用2h，红外荧光成像系统扫描。

2 结果

2.1 CDX2基因片段的获得 带有人全长的CDX2 cDNA质粒pOTB7为模板，用酶切引物和Tap高保真酶进行PCR扩增。约在1000bp处有一条特异条带，与预计长度1005bp相符。见图1。

图1 PCR扩增CDX2基因编码序列电泳图

2.2 慢病毒表达载体pWPI－CDX2的构建及鉴定PCR扩增产物及慢病毒表达载体pWPI经PmeⅠ酶切后进行连接，筛选阳性克隆，对重组质粒用全长引物进行PCR和PmeⅠ酶切鉴定，扩增出与预计长度相符的981 bp目的片段，酶切后出现预期的相应片段(11101bp和993bp)，见图2。并送测序鉴定。

图2 重组质粒pWPI－CDX2的PCR及PmeⅠ酶切鉴定

2.3 含CDX2重组慢病毒的包装及感染效果的鉴定 将慢病毒系统三质粒 pWPI－CDX2，pCMV－dR8.74，pMD2.G 共同转染 293T 细胞，转染后观察见大量强绿色荧光，证明慢病毒包装成功。慢病毒毒液感染XB1847细胞后观察到显绿色荧光的XB1847细胞，发绿色荧光细胞平均数占总细胞平均数的90%左右，证明携带CDX2基因的慢病毒载体能高效感染XB1847细胞，见图3。

2.4 携带CDX2基因慢病毒感染XB1847细胞后检测CDX2表达结果

2.4.1 PCR 检测 pWPI－CDX2 感染 XB1847 细胞后CDX2基因的表达 以pWPI－CDX2慢病毒载体质粒感染的XB1847细胞和对照组的cDNA为模板，分别用CDX2基因全长引物进行PCR扩增，pWPICDX2感染过的XB1847细胞对应的PCR产物可见到预期的清晰条带(约981 bp)，对照组未有条带出现，证明携带CDX2基因慢病毒表达载体感染XB1847细胞后CDX2基因能稳定表达。见图4。

图4 PCR检测CDX2基因的表达

2.4.2 Western Blot检测 pWPI－CDX2 感染 XB1847细胞后CDX2蛋白的表达 将pWPI－CDX2慢病毒载体质粒感染的XB1847细胞和对照组分别提取细胞的总蛋白，经 Western Blot发现，pWPI－CDX2感染的XB1847细胞泳道出现特异的条带，空载感染的对照组未有条带，说明携带CDX2基因慢病毒表达载体感染XB1847细胞后CDX2蛋白能稳定表达。见图5。

3 讨论

图5 Western Blot检测CDX2蛋白的表达

尾型同源盒基因－2(CDX2)位于染色体13ql2－ql3区，全长22－23kb，含有3个外显子和2个内含子，CDX2蛋白由311个氨基酸组成，其以螺旋－环－螺旋(helix－loop－helix，HLH)的结构与 DNA 的相应区域结合，调节DNA的表达［5］，它是一种转录因子。CHOI等报道通过免疫组织化学染色方法，对 123例结直肠癌患者进行研究，发现94例CDX2染色为阳性，且阳性染色比例跟分化程度密切相关，Stage A－D 分别为 91.7%、85.1%、69.6%、50% ，并且跟患者的淋巴结转移有关，CDX2基因表达缺失可能在结直肠癌发生过程中起重要作用［6］。许多研究也表明CDX2的表达在消化道恶性肿瘤中明显下调［7］。于秀文等［8］通过研究发现，与正常大肠组织相比较，大肠腺癌患者的组织中CDX2明显低表达，CDX2的下调表达可能参与了大肠癌的发生、发展、浸润及转移，对临床判断预后具有重要的意义。我们在前期实验中通过Western Blot检测50例直肠癌患者癌组织中的CDX2蛋白表达量明显降低，甚至亦有低分化的晚期患者表达缺失，CDX2蛋白的高表达可能抑制肿瘤细胞的增殖及浸润、转移，直肠癌患者中癌细胞的浸润扩散与其表达降低相关，CDX2对肠上皮细胞的分化调节起着关键作用，在正常大肠黏膜中CDX2可能扮演了抑癌基因的角色。

慢病毒载体是在HIV－Ⅰ病毒基础上改造而成的病毒载体系统，很多研究报道表明其能高效地将目的基因导入动物和人的原代细胞或细胞系中。慢病毒介导的基因表达作用稳定且持久，目的基因能完整的整合到宿主细胞基因组中，随细胞分裂而复制，且能高效感染并整合到非分裂细胞中，与其他传统病毒载体相比较，避免了如不整合、整合率低、只整合分裂细胞等局限性。我们使用的慢病毒载体含有氨苄青霉素抗性基因有利于筛选，且在其EMCV IRES的下游，拥有GFP荧光蛋白基因，以此作为转染标记，目前已经证明感染细胞的范围较宽，可适用于体内基因治疗，该病毒载体系统不表达CDX2基因。因此，将其作为人CDX2基因的携带者，可以充分发挥病毒载体自身所具备的优势特点，能特异性的使CDX2基因表达于人直肠癌细胞XB1847系，为研究目的基因功能提供了很好的工具［9］。

因此我们设想通过将CDX2基因片段克隆入慢病毒表达载体pWPI，后运用分子生物学技术重组质粒，并将重组质粒转染细胞293T获得病毒颗粒，再将病毒颗粒感染直肠癌细胞 XB1847，发现在XB1847细胞内表达CDX2。

本研究结果达到预期设想，我们所构建的携带CDX2基因慢病毒表达载体(pWPI－CDX2)与其辅助质粒具有很高的转染效果，通过荧光显微镜直接观察发绿色荧光的靶细胞从而间接知道靶细胞已成功被转染，大大地简化了实验过程。通过PCR和Western Blot检测验证了CDX2基因转导进XB1847细胞后能稳定表达。CDX2的致癌以及蛋白的表达调控机制十分复杂，是在体内多个基因的参与下共同完成。我们成功构建的携带CDX2基因慢病毒表达载体为今后探讨CDX2基因在直肠癌中的作用机制奠定了基础。

［1］B ECK F，CH AWENGSAKSOPHAK K，LU CKETT J，et al.A study of regional gut endoderm potency by an alysis of Cdx2 null mut ant chimaeric mice［J］.Dev Biol，2003，255(2):399－406.

［2］应健，应荣培，应崇贵，等.直肠癌组织CDX2蛋白表达及其临床意义［J］.肿瘤学杂志，2013，19(4):281－284.

［3］ZHANG MQ，LIN F，HUI P，et al.Expression of mucins，SI－MA，villin，and CDX2 in small－intestinal adenocarcinoma［J］.Am J Clin Pathol，2007，128(5):808－816.

［4］MALLO GV，SOU BEYRAN P，LISSITZKY JC，et al.Expression of the Cdx1 an d Cdx2 homeot ic genes leads to reduced malignancy in colon can cer－derived cell［J］.Biol Chem，1998，273(22):14030－14036.

［5］Davies M，Arumugam PJ，Shah VI，et al.The clinical significace of lymph node micrometastasis in stageⅠand stageⅡcolorectal cancer［J］.Clin Transl Oncol，2008，10(3):175－179.

［6］CHOI BJ，KIM CJ，CHO Y G，et al.Al tered expression of CDX2 incolorectal cancers［J］.APMIS，2006，114(1):50－54.

［7］Bai YQ，Yamamoto H，Akiyama，et al.Ectopic expression of homeodomain protein CDX2 in intestinal metaplasia and carcinomas of the stomach［J］.Cancer Lett，2002，176(1):47－55.

［8］于秀文，王显艳，孙玉荣，等.MUC2、CDX2在大肠肿瘤中联合表达的意义［J］.肿瘤防治研究，2008，35(10):715－719.

［9］Neschadim A，McCart J A，Keating A，et al.A roadmap to safe，efficient，and stable lentivirusmediated gene therapy with hematopoietic cell transplantation［J］.Biol Blood Marrow Transplant，2007，13:1407－1416.