郭泽美，任章成，陈 腾，马娜娜，房玉林,2,*

(1.西北农林科技大学葡萄酒学院，陕西 杨凌 712100；2.陕西省葡萄与葡萄酒工程技术研究中心，陕西 杨凌 712100)

植物多酚具有较强的抗氧化能力，能有效清除体内自由基、抑制脂质过氧化以及保护机体生物大分子等[1]。葡萄废弃物中含有大量以植物多酚为主的生物活性物质，如白黎芦醇、酚酸、黄酮、儿茶素、表儿茶素、原花青素等[2]，大量研究[3-6]表明这些物质具有很高的抗氧化活性，具有护肝解毒、抗菌抗癌[7-9]、抗过敏、预防高血压、皮肤保健及美容等功效[10]。

近年来我国葡萄与葡萄酒行业发展迅速，葡萄酒生产过程中产生了大量废弃皮渣。最初这些废弃物被用作肥料、饲料、燃料，甚至被当作垃圾处理，不仅利用率低，而且易造成环境污染。因此，高效利用酿酒葡萄皮渣对增加经济效益和减少环境污染均有重要意义[11]。随着人们对食品安全的关注，食品抗氧化剂正逐渐由工业合成转向天然提取[12]，而葡萄酒工业生产中产生的大量皮渣是生产天然抗氧化剂的理想原料[13]，目前已有研究者将葡萄皮渣提取物添加到肉类和食用油脂中的研究被报道[14-15]。此外，葡萄皮渣还被应用于日化、环保领域，以及被用作木质黏合剂[16]和处理污水[17]等。

干燥处理能抑制物质的呼吸作用以及其他生理作用，减少营养物质损失，避免微生物活动，有利于物质的保藏[18]。食品等加工行业常用的干燥方式主要有晒干、冻干、烘干、阴干、微波干燥及真空干燥等[19-20]。酒厂常采用日晒方式干燥葡萄皮渣以降低成本、提高效率，但有相关研究显示冷冻干燥比烘干更有利于减少干燥过程中葡萄果皮酚类物质的损失[21]。本实验拟通过研究不同干燥方式对酿酒葡萄皮渣酚类物质含量及抗氧化活性的影响，为选择最适宜葡萄皮渣的干燥工艺提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酿酒葡萄皮渣：采自新疆焉耆盆地，为葡萄酒浸渍发酵完，皮籽分离后洗净得到。

没食子酸、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、(+)-儿茶素、芦丁、p-二甲氨基-肉桂酸(p-DMACA) 美国Sigma公司；香草醛、铁氰化钾、水杨酸、甲醇(均为分析纯) 天津市博迪化工有限公司。

1.2 仪器与设备

KQ-300D E型数控超声波清洗机 昆山仪器有限公司；RC-5C-PLUS型高速冷冻台式离心机 美国Kendro公司；UV-1700紫外分光光度计、万分之一电子天平 日本岛津公司；ZMQS 5001型超纯水制备仪 美国Millipore公司；HH.W21.600S型电热恒温水浴锅 上海跃进医疗器械厂。

1.3 方法

1.3.1 干燥处理

采用日晒干燥、低温冻干、热风烘干及阴干4种对设备和条件要求较低的干燥方式，其中日晒干燥、阴干分别在新疆和硕地区室外和室内进行，其干燥温度分别约为28℃和20℃；低温冻干在实验室条件下进行，温度为－49℃；考虑到酚类物质的热敏性[22]，热风烘干温度为(60±1)℃，以防止温度过高使得酚类物质的过多损失，4种方式干燥后用液氮研磨成粉末状，密封避光保存。

1.3.2 葡萄皮渣多酚类物质提取

采用超声辅助法提取，准确称取3.00g葡萄皮粉末，用30mL酸化甲醇溶液(1mol/L HCl-MOH-水体积比1：80：19)，在100W、25℃功率条件下超声辅助提取30min，然后8000×g低温离心15min，收集上清液，重复2次，合并提取液。

1.3.3 多酚类物质的测定

1.3.3.1 总酚含量的测定

采用福林-肖卡法[23]。取50μL的提取液，加入2.5mL稀释10倍的福林肖卡试剂和2mL 7.5g/100mL的碳酸钠溶液，混匀，45℃条件下避光反应15min后于765nm波长处比色测定吸光度，每个处理重复3次，结果以没食子酸等价值表示(mg/100g)。标准曲线以没食子酸标准溶液绘制，其质量浓度梯度为0、5、10、15、20、25、30mg/L。

1.3.3.2 总类黄酮含量的测定

参照Makris等[24]的方法进行。吸取提取液0.1mL，用甲醇稀释2倍，加入0.4mL蒸馏水，0.03mL 5g/100mL的亚硝酸钠溶液，反应5min后加入0.03mL 10g/100mL的氯化铝溶液，振荡摇匀静置5min，加入0.2mL 1mol/L的碳酸钠溶液和0.24mL蒸馏水，摇匀，在510nm波长处测定吸光度。以蒸馏水替代提取液作对照。每个处理重复3次，结果以芦丁等价值表示(mg/100g)。标准曲线以芦丁标准溶液绘制，其质量浓度梯度为0、50、100、150、200、250、300mg/L。

1.3.3.3 总黄烷-3-醇含量的测定

采用p-DMACA-盐酸法[25]进行。将提取液稀释2倍后取0.1mL，加入3mL的0.1% p-DMACA的1mol/L的盐酸甲醇溶液，充分振荡混匀后，室温条件下反应10min，在640nm波长处测定吸光度，每个处理重复3次。结果以(+)-儿茶素等价值表示(mg/100g)。标准曲线以(+)-儿茶素标准溶液绘制，其质量浓度梯度为0、12.5、25、50、100、200mg/L。

1.3.3.4 总花色苷含量的测定

葡萄皮渣中总花色苷的测定采用pH示差法[26]。提取液分别用pH1.0的盐酸-氯化钠缓冲液及pH4.5的醋酸-醋酸钠缓冲液稀释20倍，15min后分别在510nm与700nm波长处测定这2种稀释液的吸光度。最后吸光度(A)通过公式(1)计算。

总花色苷含量用矢车菊素-3-葡萄糖苷(CGE，mg/L)表示，并通过公式(2)计算。

式中：MW为矢车菊素-3-葡萄糖苷相对分子质量(449)；DF为稀释倍数；ε为摩尔吸光系数(29600L/(mol·cm))；Ve为提取液总体积(0.06L)；m为葡萄皮取样质量(3.00g)。

1.3.4 抗氧化能力测定

1.3.4.1 DPPH自由基清除力的测定

参考江慎华等[27]的方法。DPPH反应液的配制：将12.5mg DPPH试剂用甲醇溶解，定容至100mL，配成125mg/L的DPPH母液。使用时稀释5倍至25mg/L，并且现配现用。

移取0.1mL稀释10倍的提取液，加3.9mL DPPH甲醇溶液，在避光条件下反应20min，在515nm波长处测定吸光度，并以相同体积的15%乙醇代替葡萄皮提取液样品为对照，结果以Trolox等价值(μmol Trolox/g)表示。标准曲线以没食子酸标准溶液绘制，其质量浓度梯度为0、20、40、60、80、100mg/L。

1.3.4.2 铁氰化钾还原力(PFRA)的测定

参考韩林等[28]的方法进行。取0.1mL提取液，依次加入2.5mL 0.2mol/L磷酸二氢钠-磷酸一氢钠缓冲液(pH 6.6)、2.5mL 1g/100mL铁氰化钾溶液，混匀后置于50℃水浴锅中反应20min，取出快速放入冰水浴中冷却5min，再加入2.5mL 10g/100mL三氯乙酸溶液混匀，于6000×g离心10min。吸取1mL上清液，并依次加入2.5mL去离子水，0.5mL 0.1g/100mL三氯化铁溶液，混匀，反应5min后于700nm波长处测定吸光度。抗氧化活性大小由吸光度反映，吸光度越大表示抗氧化能力越强。

1.4 数据处理

实验数据采用Microsoft Excel 2010处理，用IBM SPSS Statistics 19.0进行分析。

2 结果与分析

2.1 不同干燥方式葡萄皮渣干燥效果比较

表1 不同干燥方式下葡萄皮渣的含水量和干燥时间Table 1 Moisture content of grape skin and drying time needed for different drying methods

由表1可知，葡萄皮渣相对含水量为：烘干＜晒干＜阴干＜冻干，除冻干和阴干外，不同干燥方式间有极显著差异(P＜0.01)；而干燥时间也有相同的趋势，即烘干＜晒干＜阴干＜冻干，且相互间差异达到极显著水平(P＜0.01)。这是由于温度越高，水分运动越剧烈，有利于水分散失，使得葡萄皮渣含水量越低，所需干燥时间越短。

2.2 不同干燥方式葡萄皮渣的多酚类物质含量

图 1 不同干燥方式条件下葡萄皮渣总酚含量Fig.1 Total polyphenols content of grape skin processed by different drying methods

实验测得没食子酸标准曲线方程为y=0.0174x+0.0089(R2=0.997)。由图1可知，4种干燥方式处理的葡萄皮渣，其总酚含量大小顺序为：烘干＞晒干＞阴干＞冻干，且不同干燥方式之间都存在极显著差异(P＜0.01)。其中烘干样品总酚含量为88.84mg/100g，而干燥条件更为温和的阴干和低温冻干却分别只有71.45、47.63mg/100g，这可能是由于多酚氧化酶的作用。Jang等[29]认为多酚氧化酶(PPO)在室温条件下最为活跃，而在温度较高时其活性受到抑制，温度高于70℃时甚至会失活。Gabriela等[30]通过研究发现葡萄多酚氧化酶活性在25℃时最大，并随温度增高而逐渐下降；而其稳定性随温度增高而下降。热风烘干和晒干温度分别为(60±1)℃和28℃，较高的温度使得多酚氧化酶活性降低，从而使得皮渣酚类物质损失较少；阴干过程中葡萄皮渣中多酚物质在多酚氧化酶作用下损失较多，而冻干过程中多酚氧化酶在低温条件下较为稳定，虽然其活性在低温下受到抑制，但冻干结束后的回温过程其活性得以增强，从而造成皮渣多酚物质的损失。此外，干燥时间对皮渣多酚化合物含量产生直接影响。这是由于在干燥过程中，葡萄皮渣与氧气充分接触，多酚氧化酶对多酚化合物的氧化起催化作用，干燥时间越长，多酚氧化酶作用时间也越长，多酚化合物因氧化损失也就越多。

图 2 不同干燥方式条件下葡萄皮总类黄酮的含量Fig.2 Total fl avonoids content of grape skin processed by different drying methods

由图2可知，不同干燥方式的葡萄皮渣总类黄酮含量大小依次为：晒干＞烘干＞阴干＞冻干，最高值为403.56mg/100g，最低值为111.78mg/100g，4种干燥方式间均存在极显著差异(P＜0.01)。类黄酮包括花青素、黄酮醇、黄烷醇及原花青素等，是葡萄果皮中含量较多的一类酚类化合物，与其他酚类化合物一样，类黄酮对温度也比较敏感。研究表明高温(45℃)条件下长时间存放均会使总类黄酮含量减少[31]，但短时间的高温处理对总酚和总类黄酮含量影响较小[32]。与总酚情况类似，烘干和晒干的葡萄皮渣，因为温度较高、干燥较快，能有效抑制相关酶的活性和降低其稳定性，减少其作用时间，使得总类黄酮含量较阴干和冻干处理的多；而高温可能在一定程度上使类黄酮分解，使得晒干处理的总类黄酮含量较烘干处理多。阴干和冻干的葡萄皮渣干燥时间太久，所以总酚和总类黄酮含量都要低。

图 3 不同干燥方式条件下葡萄皮渣总黄烷-3-醇的含量Fig.3 Total fl avan-3-ols content of grape skin processed by different drying methods

由图3可知，不同干燥处理的葡萄皮渣中，烘干处理的样品总黄烷-3-醇含量最高，达276.15mg/100g；然后依次为晒干、阴干、冻干，其中冻干处理最低，为105.82mg/100g，且4种干燥方式间均存在极显著差异(P＜0.01)。与总酚含量测定结果相同，不同干燥条件下多酚氧化酶的活性和稳定性差异以及作用时间的不同是导致该结果的重要原因。

图 4 不同干燥方式条件下葡萄皮渣总花色苷含量Fig.4 Total anthocyanins content of grape skin processed by different drying methods

由图4可知，烘干处理的葡萄皮渣总花色苷含量最高为5.95mg/g，其次为冻干、晒干、阴干，含量分别为4.78、4.37、4.15mg/g，相互间均存在极显著差异(P＜0.01)。花色苷大量存在于葡萄果皮中，是葡萄重要的呈色物质。花色苷稳定性较差，受pH值、氧气、酶、光及温度等因素影响[33]。温度对花色苷影响非常大。首先，温度影响花色苷的热稳定性，研究[34]表明在高温和贮存过程中花色苷会不断降解；其次，温度可以通过控制酶活性来影响花色苷含量。烘干过程温度较高，会导致花色苷热分解，但所需干燥时间较少，从而在一定程度上减少了花色苷的损失；且高温有助于抑制相关酶的活性，有效防止了花色苷因酶催化降解，因而其花色苷含量最高。冻干处理虽温度低能避免花色苷受热分解，但其干燥过程缓慢，可能使得酶作用时间较长使得花色苷损失较多；除较高温度的作用外，光也能加速花色苷的降解，因此晒干处理的皮渣较冻干的花色苷含量低；适宜酶作用的温度及较长的干燥时间使得阴干处理的花色苷最少。

2.3 不同干燥方式葡萄皮渣的抗氧化能力

DPPH自由基清除能力是常见的评价抗氧化能力的指标，与总酚含量呈正相关，并与总抗氧化能力也有很强的相关性[25-26]。由图5可知，4种干燥方式处理的葡萄皮渣的DPPH自由基清除能力存在极显著差异(P＜0.01)，其中烘干最优，然后依次为晒干、阴干、冻干处理，这与总酚含量测定结果一致。

图 5 不同干燥方式条件下葡萄皮DPPH自由基清除能力Fig.5 DPPH scavenging capacity of grape skin processed by different drying methods

图 6 不同干燥方式条件下葡萄皮铁氰化钾还原能力Fig.6 Potassium ferricyanide reducing power of grape skin processed by different drying methods

抗氧化活性受反应条件、底物及产物影响，与DPPH自由基清除力相比，铁氰化钾还原力从另一个方面反映体系的抗氧化活性。由图6可知，不同干燥处理葡萄皮渣的铁氰化钾还原能力由高到低分别为：烘干＞晒干＞阴干＞冻干，相互间均存在极显著差异(P＜0.01)。该结果与总酚含量及DPPH自由基清除力相一致。

综合DPPH自由基清除力和铁氰化钾还原力情况来看，不同干燥方式的葡萄皮渣抗氧化活性差异显著，且烘干＞晒干＞阴干＞冻干。

2.4 相关性分析

表2 干燥葡萄皮渣中酚类物质及抗氧化活性的相关性分析Table 2 Correlation analysis between polyphenol content and antioxidant activity of dry grape skin

由表2可知，除总花色苷含量外，其他各指标间均呈正相关，其中总黄烷-3-醇与总酚含量、DPPH自由基清除能力和铁氰化钾还原力均呈显著相关性(P＜0.05)，总酚含量与铁氰化钾还原力显著相关(P＜0.05)。表明总酚含量、总黄烷-3-醇含量及抗氧化性之间关系密切。

3 结 论

葡萄皮渣经晒干、冻干、烘干和阴干处理后，相互间总酚、总类黄酮、总黄烷-3-醇含量和总花色苷含量差异极显著(P＜0.01)，其中烘干样品的总酚、总黄烷-3-醇含量和总花色含量均最高，其抗氧化能力也最强。各指标间均呈正相关，其中总酚含量和总黄烷-3-醇含量与抗氧化能力相关性显著(P＜0.05)。综合评价得烘干干燥处理下葡萄皮渣多酚类物质损失最少，其抗氧化能力最好；其次为日晒干燥处理。考虑到葡萄酒厂在生产过程中产生的皮渣量较大，采用日晒干燥葡萄皮渣更为经济合理。

[1] 凌智群, 张晓辉. 原花青素的药理学研究进展[J]. 中国药理学通报, 2002, 18(1)： 19-12.

[2] IACOPINI P, BALDI M, STORCHI P, et al. Catechin, epicatechin, quercetin, rutin and resveratrol in red grape： content, in vitro antioxidant activity and interactions[J]. Journal of Food Composition and Analysis, 2008, 21(8)： 589-598.

[3] 吕丽爽, 曹栋. 脱脂葡萄籽中的低聚原花青素的提取[J]. 无锡轻工大学学报, 2001, 20(2)： 208-210.

[4] SHI J, YU J, POHORLY J E, et al. Polyphenolics in grape seedsbiochemistry and functionality[J]. Journal of Medicinal Food, 2003, 6(4)： 291-299.

[5] KIRIMLIOGLU V, ARA C, YILMAZ M, et al. Resveratrol, a red wine constituent polyphenol protects gastric tissue against the oxidative stress in cholestatic rats[J]. Digestive Diseases and Sciences, 2006, 51(2)： 298-302.

[6] NEGRO C, TOMMASI L, MICELI A. Phenolic compounds and antioxidant activity from red grape marc extracts[J]. Bioresource Technology, 2003, 87(1)： 41-44.

[7] 赵文恩. 葡萄皮渣原花青素提取分离的初步研究[J]. 食品科学, 2000, 21(12)： 68-69.

[8] CASTILLO-PICHARDO L, MARTÍNEZ-MONTEMAYOR M M, MARTÍNEZ J E, et al. Inhibition of mammary tumor growth and metastases to bone and liver by dietary grape polyphenols[J]. Clin Exp Metastasis, 2009, 26(6)： 505-516.

[9] 李建慧, 马会勤, 陈尚武. 葡萄多酚抑菌效果的研究[J]. 中国食品学报, 2008, 8(2)： 100-107.

[10] 冯丽, 宋曙辉. 植物多酚种类及其生理功能的研究进展[J]. 江西农业学报, 2007, 19(10)： 105-107.

[11] CAMPOS L M A S, LEIMANN F V, PEDROSA R C, et al. Free radical scavenging of grape pomace extracts from Cabernet Sauvingnon (Vitis vinifera)[J]. Bioresource Technology, 99(17)： 8413-8420.

[12] FORMANEK Z, KERRY J P, HIGGINS F M, et al. Addition of synthetic and natural antioxidants tocopheryl acetate supplemented beef patties： effects of antioxidants and packaging on lipid oxidation[J]. Meat Science, 2001, 58(4)： 337-341.

[13] SPIGNO G, de FAVERI D M. Antioxidants from grape stalks and marc： influence of extraction procedure on yield, purity and antioxidant power of the extracts[J]. Journal of Food Engineering, 2007, 78(3)： 93-801.

[14] SÁNCHEZ-ALONSO I, JIMÉNEZ-ESCRIG A, SAURA-CALIXTO F, et al. Antioxidant protection of white grape pomace on restructured fish products during frozen storage[J]. LWT-Food Science and Technology, 2008, 41(1)： 42-50.

[15] NASSU R T, GONCALVES L A G, PEREIRA da SILVA M A A, et al. Oxidative stability of fermented goat meat sausage with different levels of natural antioxidant[J]. Meat Science, 2003, 63(1)： 43-49.

[16] LAN Ping, BROSSE N, CHRUSCIEL L, et al. Extraction of condensed tannins from grape pomace for use as wood adhesives[J]. Industrial Crops and Products, 2011, 33(1)： 253-257.

[17] FARINELLA N V, MATOS G D, ARRUDA M A Z. Grape bagasse as a potential biosorbent of metals in effluent treatments[J]. Bioresource Technology, 2007, 98(10)： 1940-1946.

[18] Di SCALA K C, CRAPISTE G H. Drying kinetics and quality changes during drying of red pepper[J]. LWT-Food Science and Technology, 2008, 41： 789-795.

[19] MUELLER-HARVEY I. Analysis of hydrolysable tannins[J]. Animal Feed Science and Technology, 2001, 91： 3-20.

[20] VAGHRI Z. Antioxidant components and color characteristics of blueberries dried by different methods[D]. Vancouver： University of British Columbia, 2000.

[21] de TORRES C, DÍAZ-MAROTOA M C, HERMOSÍN-GUTIÉRREZ I, et al. Effect of freeze-drying and oven-drying on volatiles and phenolics composition of grape skin[J]. Analytica Chimica Acta, 2010, 660(1/2)： 177-182.

[22] SPIGNO G, de FAVERI D M. Antioxidants from grape stalks and marc： influence of extraction procedure on yield, purity and antioxidant power of the extracts[J]. Journal of Food Engineering, 2007, 78： 793-801.

[23] JAVANMARDI J, STUSHNOFF C, LOCKE E J, et al. Antioxidant activity and total phenolic content of Iranian Ocimum accessions[J]. Food Chemistry, 2003, 83(4)： 547-550.

[24] MAKRIS D P, BOSKOU G, ANDRIKOPOULOS N K. Polyphenolic content and in vitro antioxidant characteristics of wine industry and other agri-food solid waste extracts[J]. Journal of Food Composition and Analysis, 2007, 20(2)： 125-132.

[25] LI Yuguang, TANNER G, LARKIN P. The DMACA-HCl protocol and the threshold proanthocyanidin content for bloat safety in forage legumes[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 1996, 70： 89-101.

[26] FANG Yulin, MENG Jiangfei, ZHANG Ang, et al. Influence of shriveling on berry composition and antioxidant activity of Cabernet Sauvignon grapes from Shanxi vineyards[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2011, 91(4)： 749-751.

[27] 江慎华, 吴士云, 马海乐, 等. 诃子抗氧化活性物质提取工艺与抗氧化活性研究[J]. 农业机械学报, 2011, 42(4)： 120-126.

[28] 韩林, 黄玉林, 张海德, 等. 槟榔籽中抗氧化成分的提取及活性研究[J]. 食品与发酵工业, 2009, 35(9)： 157-163.

[29] JANG J, MA Y, SHIN J, et al. Characterization of polyphenoloxidase extracted from Solanum tuberosumjasim[J]. Food Sci Biotech, 2005, 14(1)： 117-122.

[30] GABRIELA R, ANN V L, CHANTAL S, et al. Biochemical characterization and process stability of polyphenoloxidase extracted from Victoria grape (Vitis vinifera ssp. sativa)[J]. Food Chemistry, 2006, 94(2)： 253-261.

[31] TSANTILI E, KONSTANTINIDIS K, CHRISTOPOULOS M V, et al. Total phenolics and flavonoids and total antioxidant capacity in pistachio (Pistachia vera L.) nuts in relation to cultivars and storage conditions[J]. Scientia Horticulturae, 2011, 129(4/27)： 694-701.

[32] LAFUENTE M T, BALLESTER A R, CALEJERO J, et al. Effect of high-temperature-conditioning treatments on quality, flavonoid composition and vitamin C of cold stored ‘Fortune’ mandarins[J]. Food Chemistry, 2011, 128(4)： 1080-1086.

[33] 孙建霞, 张燕, 胡小松, 等. 花色苷的结构稳定性与降解机制研究进展[J]. 中国农业科学, 2009, 42(3)： 996-1008.

[34] KIRCA A, ÖZKAN M, CEMEROLU B. Effects of temperature, solid content and pH on the stability of black carrot anthocyanins[J]. Food Chemistry, 2007, 101(1)： 212-218.