王世成，王颜红,*，刘艳辉，崔杰华，张 红，齐 伟，李林平

(1.中国科学院沈阳应用生态研究所，辽宁 沈阳 110016；2.中国绿色食品发展中心，北京 100081)

硒是人体必需的微量元素，具有抗氧化和增强免疫力的生物学功能[1]，对人体健康有着极为重要的意义。研究[2-4]表明，无机硒毒性大，生物活性低；而有机硒毒性小，吸收率高，生物利用率高，因此，有机硒产品的研制是当前的研究热点之一，其中富含有机硒的鸭蛋是常用的补硒产品之一，愈来愈受到重视。目前，在我国市场上已经有富硒鸭蛋销售，但是，由于缺乏有效的有机硒测试方法，使得富硒鸭蛋的质量难以有效的控制。

目前，总硒的测定方法有分光光度法[5]、原子吸收光谱法[6]、电感耦合等离子体发射光谱法[7]、氢化物-发生原子荧光光谱法[8]等等。对于样品中有机硒的测定，有文献报道采用分光光度法测定富硒酵母中有机硒的含量[9]；采用氢化物发生-原子荧光光谱法测定富硒酵母中有机硒和无机硒[10]；采用顺序注射氢化物发生原子荧光法测定农产品中的无机硒和有机硒[11]；采用液相色谱-质谱联用方法测定硒蛋氨酸的方法[12]等。上述文献的测试方法大多是针对植物、微生物产品，而动物性食品中有机硒总量的测定方法还未见报道。对于鸭蛋中总硒的测定，有文献报道了分光光度法测定富硒蛋粉中总硒含量的方法[13]和氢化物原子荧光光谱法测定鸡蛋中总硒含量方法[14]。有文献报道采用高效液相色谱-等离子体质谱联用技术分析富硒鸡蛋中两种硒代氨基酸[15]，但该方法对仪器和技术要求较高，不适宜普遍推广应用。为此，在能够测定鸭蛋总硒的前提下，本方法采用三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲溶液提取，硫酸铵沉淀的方法，有效分离鸭蛋样品中的无机硒和有机硒，采用原子荧光法测定其中的总硒和无机硒，应用差减法计算有机硒的含量。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

普通鸭蛋和富硒鸭蛋均采自辽宁省大连某蛋鸭养殖企业。

硝酸、高氯酸、盐酸均为优级纯；pH8.6的Tris-HCl缓冲溶液：称取1.211g三羟甲基氨基甲烷，0.404g MgCl2·6H2O，用80mL水将其溶解，用6mol/L盐酸调节pH值至8.6，用去离子水定容至100mL。NaBH4(20g/L)和NaOH(4g/L)的混合溶液：分别称取6g NaBH4和1.2g NaOH，加入300mL去离子水将其溶解并定容，现用现配；铁氰化钾溶液(100g/L)：称取10.0g铁氰化钾(K3Fe(CN)6)溶于100mL水中，混匀；硒标准储备溶液：1000mg/L。硒标准应用液：取1000mg/L硒标准储备液逐级稀释，分别得到质量浓度为500μg/L和100μg/L的溶液。

1.2 仪器与设备

AFS-2202E型原子荧光光谱仪(配有硒空心阴极灯) 北京海光仪器公司；KQ-250B型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；KGB-2型电热板 沈阳市森华理化仪器研究所；TDL-40C型离心机 上海安亭科学仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 总硒的测定

按GB/T 5009.93—2003《食品中硒的测定》方法测定。

1.3.2 无机硒的测定

1.3.2.1 无机硒的提取

称取混合均匀的鸭蛋样品1g(精确到0.001g)，加入Tris-HCl缓冲溶液(pH8.6)10mL，超声提取2h；4000r/min离心10min，移出上清液，加入6g硫酸铵，混匀，静置10min，以4000r/min离心10min，移出清液；残渣中再加入0.6g硫酸铵，同时加入1mL Tris-HCl缓冲溶液润洗后，离心，合并清液。同时做空白实验。

1.3.2.2 提取液的消解

吸取离心后的提取清液(1.3.2.1节)，加入10mL混酸(硝酸：盐酸(4：1，V/V))，加热消解，并及时补加混酸，待溶液变为澄清无色并伴有白烟时，继续加热至剩余量为1～2mL时；再加入5mL盐酸溶液(6mol/L)，继续加热至清亮无色并伴有白烟出现，冷却，转移至25mL容量瓶中，加入盐酸5.0mL、铁氰化钾溶液2.5mL，用去离子水定容至刻度，混匀待测。

1.3.2.3 标准曲线的配制

取50mL容量瓶6支，依次准确加入100μg/L硒标准使用液0、1.0、2.5、5.0mL和500μg/L的硒标准使用液2.0、5.0mL，分别加入盐酸10.0mL、铁氰化钾溶液(100g/L)5.0mL，用去离子水定容至刻度(各相当于硒质量浓度0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0μg/L)，混匀待测。

1.3.2.4 仪器测定条件

原子化器高度：8mm；灯电流：80mA；载气流量：400mL/min；屏蔽气流量：1000mL/min；原子化温度：800℃；光电倍增管负高压：300V；延迟时间：1s；读数时间：12s；进样体积：1mL。

1.3.2.5 测定

在测定标准系列溶液后，分别吸取空白溶液和试样溶液进行测定。

1.3.3 有机硒总硒的含量减去无机硒的含量即得有机硒含量。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

配制硒质量浓度为2.0～50μg/L的标准溶液，按建立的方法，以硒质量浓度(μg/L)为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制标准曲线y=32.378x－50.631，R2=0.9999，测定质量浓度在2.0～50μg/L线性关系良好，适用于样品的测定分析。

2.2 提取剂的选择

鸭蛋中的硒主要以蛋白的结合形式存在，Tris-HCl缓冲溶液可作为蛋白的理想提取试剂，因此采用该溶液作为鸭蛋中的有机硒和无机硒提取剂。参考文献[7]考察在提取液中加入甘油增加提取效果，结果发现提取剂中添加一定量的甘油，在消解的过程中，容易产生过热的迸溅现象影响结果的平行性，没有添加甘油的测试结果平行性较好。故采用不含甘油的pH8.6的Tris-HCl缓冲溶液提取，以利于减少样品在消解过程中的损失。

2.3 沉淀剂的选择

表 1 不同沉淀剂的效果Table 1 Effect of different precipitant on the recovery of selenium

采用溶剂提取获得有机硒和无机硒溶液后，通过沉淀蛋白的方式去除有机硒，比较采用硫酸铵和无水乙醇作为沉淀剂沉淀蛋白的效果。称取1g样品，加入一定量的硒标准溶液，加入10mL的pH8.6 Tris-HCl缓冲溶液，超声提取2h，再分别加入0.6g硫酸铵固体和15mL无水乙醇沉淀蛋白，以4000r/min离心10min，上清液定容至25mL，按建立的方法消解分析，结果见表1。结果表明，无水乙醇做沉淀剂有利于溶液和沉淀的分离，但测得的加标回收率偏低。用硫酸铵固体作沉淀剂回收率较高，虽然溶液和沉淀不容易分离，但可通过高速离心和增加离心时间实现。故采用硫酸铵作为蛋白沉淀剂。

2.4 精密度实验和方法的检出限

方法精密度：样品中添加无机硒标准溶液，添加量为0.4mg/kg、按照本方法确定的条件进行重复性实验，其相对标准偏差RSD≤5%。说明本方法用于测定鸭蛋中无机硒的含量有较好的精密度。

表 2 方法的精密度(n=5)Table 2 Precision test (n=5)

根据限量检测要求，连续11次测量样品空白对照液，按3倍标准偏差计算其检出限(3σ)为0.09μg/L，按称样1g计算，定容25mL计算，无机硒的检出限为0.003mg/kg。

2.5 回收率实验

以普通鸭蛋为样品，分别添加0.4、1.0mg/kg和2.0mg/kg的硒标准溶液，按建立的方法，测定了无机硒的回收率，每个样品做3个平行，结果见表3。结果表明，3种加标量的无机硒添加回收率在82.8%～91.0%之间，基本满足样品测定的需求，通过差减法得到的样品的有机硒含量是真实可信的。

表 3 无机硒的回收率Table 3 Recoveries of inorganic selenium

2.6 样品中有机硒的测定

表 4 样品中有机硒和无机硒的测定 Table 4 Determination of organic selenium and inorganic selenium in samples

按照建立的方法，测定了3批富硒鸭蛋样品中无机硒和有机硒含量，结果见表4。结果表明，富硒鸭蛋中的有机硒占总硒的95.2%和95.9%，无机硒占总量的4.8%和4.1%，无机硒的测定结果与Lipiec等[15]分析结果基本相符。Lipiec分析富硒鸡蛋中的硒蛋氨酸和硒半胱氨酸，二者的总和占总硒的75%，无机硒占总量的6.4%，说明两种硒代氨基酸的含量只代表了大部分有机硒但并不是全部。

3 结 论

建立了鸭蛋中有机硒和无机硒的测定方法，采用Tris-HCl缓冲溶液提取，硫酸铵沉淀，原子荧光法测定其中的总硒和无机硒，采用差减法计算有机硒的含量，方法灵敏度高，线性范围，精密度以及加标回收率均获得满意结果。为鸭蛋中有机硒和无机硒的测定提供了一种完善检测方法。

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