曹 娅，孙 利，凌 云，赵延胜,3，高 慧，冯 峰，储晓刚,*

(1.中国检验检疫科学研究院，北京 100123；2.山东农业大学食品科学与工程学院，山东 泰安 271018；3.江苏大学食品与生物工程学院，江苏 镇江 212013)

食用调味油是从植物或植物籽粒中提取的油脂或萃取呈味成分于植物油中的调味品，其主要成分为植物油。而植物油在长期储存过程中会发生酸败、腐败变质，产生小分子醛、酮类的物质危害人体健康。为了延缓其加工、贮藏以及食用过程中的氧化酸败，改变油脂的表观状态，从而增加其销售量，生产者常常在食用植物油中加入抗氧化剂等食品添加剂。但是，目前使用的食品添加剂大多是人工合成化合物，而食品生产过程中添加剂的违法超标现象也十分严重，超标使用会对人体造成不同程度的危害。同时一些非法添加物的加入，如三聚氰胺，苏丹红类色素会对老百姓的身体健康造成极大的损害。因此，加强食用植物油和调味油中食品添加剂检测方法的研究，开发该类样品中添加剂(物)的检测方法是加强食品中添加剂和非法添加物监管的有效途径[1-2]。

当前，针对食品添加剂常用检测分析方法主要有生物传感器法[3]、酶联免疫法[4]、胶束电动毛细管色谱法(micellar electrokinetic capillary chromatography，MECC)[5]、离子色谱法[6]、气相色谱法[7]、液相色谱法[8-9]、气相色谱-质谱法(gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS)[10-11]和液相色谱-质谱法[12]。生物传感器法的灵敏度较低，毛细管电泳法精确度较低，Boyce[5]采用的MECC法检测果酱和饮料中的食品添加剂的迁移时间RSD均大于在10.1%～20.1%之间。离子色谱法和酶联免疫法的检测范围较窄：涂顺等[4]使用酶联免疫法只检测了食品中的苏丹类染色剂，离子色谱法适用于检测有机酸和糖类，姚浔平等[13]使用离子排阻色谱法检测啤酒中的有机酸。而气相色谱质谱联用法的检测范围又有一定的限制。液相色谱方法的检测范围广，选择性好，但是准确度不如质谱，可能产生假阳性检测结果。目前，液相色谱串联质谱法的技术可对化合物进行同时定性定量，准确性较高，能够满足精确分析的要求。

为了去除基质干扰，提高方法的灵敏度，前处理方法的优化必不可少。目前用于食用植物油中食品添加剂检测的常规前处理方法有固相萃取法(solid phase extraction，SPE)[14]、液液萃取法(liquid liquid extraction，LLE)[15]等。植物油和调和油主要成分为长链脂肪酸，采用液液萃取法便可将极性较强的抗氧化剂、防腐剂和甜味剂萃取出来，同时与油样基质互溶的、难以萃取的弱极性苏丹类化合物可采用凝胶渗透色谱进行分离。本实验应用高效液相色谱-串联四极杆质谱技术，通过优化前处理方法和色谱质谱条件，拟建立食用植物油和调味油中27种食品添加剂及非法添加物的定量方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乙腈(HPLC级) 德国Merck公司；正己烷(HPLC级) 美国Honeywell公司；乙酸乙酯、环己烷(均为HPLC级) 美国Fisher科技公司。

根据化合物在质谱上的电离模式，将27种目标化合物分为A、B两组，其中A组化合物苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ、苏丹红G、苏丹红7B、苏丹橙G、苏丹黄和对位红(纯度均大于97%) 美国Sigma-Aldrich公司；B组化合物水杨酸、乙萘酚、脱氢乙酸、联苯酚和糖精(纯度均大于98%) 瑞士Fluka公司；2,4-二氯乙酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、特丁基对苯二酚、叔丁基对羟基茴香醚、己基间苯二酚、2,4,5-三羟基苯丁酮、没食子酸丙酯、对羟基苯甲酸苄酯、3,5-二叔丁基-4-羟基苄醇、没食子酸辛酯和去甲二氢愈创木酚(纯度均大于97%) 美国Sigma-Aldrich公司，实验用水均为超纯水 美国Millpore公司。

1.2 仪器与设备

1200高效液相色谱仪 美国Agilent公司；串联API5000三重四极杆质谱仪 美国Applied Biosystem公司；凝胶渗透色谱 德国LCTech公司；旋转蒸发仪 布琪公司。

1.3 样品前处理

称取油样品0.5g(精确到0.01g)置于50mL离心管中，加入20mL乙腈饱和正己烷和5mL正己烷饱和乙腈，振荡提取5min后，于10000r/min离心5min，移走乙腈层，正己烷层重复提取1次，合并乙腈层，用超纯水定容至10mL，取1mL样液采用0.2μm的滤膜过滤，待测。正己烷层经旋转蒸发仪浓缩至干，用乙酸乙酯-环己烷(1：1，V/V)的溶剂定容至10mL，经凝胶渗透色谱除去油脂等杂质，洗脱液经旋转蒸发仪浓缩至干，1mL乙腈定容后，0.2μm滤膜过滤，待测。

1.4 仪器条件

1.4.1 A组化合物的仪器条件

色 谱柱：A g i l e n t A t l a n t i s T 3 色谱柱(5 μ m，6mm×150mm)；柱温：35℃；进样体积5μL。流动相A为超纯水，流动相B乙腈，梯度洗脱程序如下：0～1min，10%A；1～10min，10%～0%A；10～20min，0%A；20～20.01min，0%～10%A；20.01～24min，10%A。流速为0.50mL/min。

电喷雾离子源(electrospray ionization，ESI)：正离子模式；毛细管电压：5.5kV；碰撞气：10psi，气帘气：25psi，雾化气：50psi，辅助气：40psi，离子源温度：550℃。各化合物采用多反应监测(multiple reaction monitoring，MRM)方式，母离子/子离子对均设为单位分辨，各参数见表1。

1.4.2 B组化合物仪器条件

色谱柱：A g i l e n t A t l a n t i s T 3 色谱柱(5 μ m，6mm×150mm)；柱温：40℃；进样体积5μL。流动相A为0.1%乙酸溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱程序如下：0～12min，60～10% A；12～20min，10% A；20～20.01min，10～60% A；20.01～29min，60% A。流速0.5mL/min。

电喷雾离子源：负离子模式；毛细管电压：4.5kV，碰撞气：5kPa，气帘气：15kPa，雾化气：40kPa，辅助气：25kPa，离子源温度：550℃。各化合物采用MRM多反应监测方式，母离子/子离子对均设为单位分辨，各参数见表1。

表 1 ESI模式下各化合物的质谱条件Table 1 Mass spectral conditions for detecting 27 compounds in standard solutions

2 结果与分析

2.1 样品前处理条件的优化

2.1.1 萃取试剂的选择及萃取次数的优化

本实验样品为植物油和调和油，其主要成分为长链脂肪酸，采用液液萃取方式便可将极性较强的抗氧化剂、防腐剂和甜味剂萃取出来。实验对比乙腈、甲醇和水对B组化合物的萃取效果，在相同的油样中加入质量浓度为100μg/L的混合标准溶液，萃取结果如图1所示，大多数化合物在乙腈作为萃取液时萃取效率较高，因此选择乙腈作为B组化合物的萃取液。为了保证目标化合物的萃取回收率，并且尽量减少前处理的繁琐步骤以及目标化合物的损失。本实验对乙腈的提取次数进行比较，在油样中加入100μg/L的混合标准液后振荡萃取1、2、3次，每次萃取完毕后乙腈层都定容上机测定。结果表明两次萃取的回收率在86.5%～110.1%之间，满足检测要求。因此，本实验的萃取次数选择两次。

图 1 不同提取液下防腐剂、抗氧化剂和甜味剂的色谱峰响应值Fig.1 Effect of extraction solvents on chromatographic peak responses of food additives

2.1.2 GPC条件优化

图 2 色素的GPC收集情况图Fig.2 GPC profiles of food pigments

由于食用调味油中含有的主要成分为植物油，本实验对市场上销售的植物油：花生油、菜籽油、芝麻油、棉籽油、葵花籽油、亚麻油、红花籽油和大豆油进行了GPC分析。分别取以上各植物油进行紫外分析，结果表明各油样的出峰时间都在16min之前。通过分段收集和分析对色素的洗脱时间进行确定。油样中加入A组化合物标准液后，收集十个小瓶，每个小瓶收集300s。实验结果如图2所示，表明A组化合物在35min内可收集完全。因此GPC方法为前馏分1000s不收集；1000～2200s收集；2200～2500s冲洗凝胶色谱柱，不收集。

2.2 色谱条件的优化

2.2.1 B组化合物的流动相优化

由于电喷雾质谱的电离是在溶液状态电离，因此流动相的组成除了影响分析物的保留时间和峰形外，还会影响到分析物的离子化效率，从而影响到目标化合物的检测灵敏度。本实验对于B组化合物分别采用乙腈-0.1%甲酸溶液、乙腈-0.1%乙酸溶液、乙腈-5mmol/L的乙酸铵/乙酸缓冲溶液和乙腈-5mmol/L的甲酸铵/甲酸缓冲溶液4个体系作为流动相,考察不同流动相组成对于分析物峰形，离子化效率的影响。由于0.1%的甲酸和加入缓冲盐的流动相对于体系的抑制过于强烈，所以色谱峰的响应较低。从图3可以看出，以乙腈-0.1%乙酸溶液作为流动相时大多数添加剂的响应值最高。因此，本实验采用乙腈和0.1%乙酸水作为流动相。

图 3 不同流动相下防腐剂、抗氧化剂和甜味剂的色谱峰响应值Fig.3 Effect of mobile phase composition on chromatographic peak responses of food additives

2.2.2 A组流动相的优化

图 4 不同流动相下的油溶性色素的色谱峰响应值Fig.4 Effect of mobile phase composition on chromatographic peak responses of oil-soluble pigments

对于A组化合物流动相选择，实验比较乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸溶液、乙腈-20mmol/L乙酸铵溶液和乙腈-20mmol/乙酸铵/0.1%乙酸缓冲溶液四个体系，由于超纯水对于本实验的体系有较少的抑制作用，色谱峰的响应较高。如图4所示，以超纯水作为流动相时大多数添加剂的响应值最高。因此，本实验采用乙腈和超纯水作为流动相。

表 2 各化合物的线性范围、线性方程、相关系数、添加回收率、精密度及检出限(n=5)Table 2 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients, recoveries, precision (RSD) and limits of detection (n=5)

2.2.3 柱温的选择

图 5 优化条件下防腐剂、抗氧化剂和甜味剂标准溶液的MRM色谱图Fig.5 MRM chromatograms of preservatives, antioxidants and sweeteners under the optimum conditions

柱温在液相色谱梯度洗脱过程中可以发挥重要作用，首先，提高柱温可以缩短保留时间，其次，温度的不平衡会导致峰扭曲变形。因此，如果想得到稳定可靠的分离结果，色谱柱的温度变化是不可忽视的。本实验比较的柱温分别为30、35、40℃和45℃，通过峰形的对比，对于B组化合物的较优柱温为40℃，对于A组化合物的较优柱温为35℃。

2.3 质谱条件的优化

通过单个分析物标准品溶液上机分析，得到目标分析物的质荷比。为了进一步对化合物进行确证分析，在碰撞诱导解析电离模式(collision induced dissociation，CID)下，通过分析单个目标物标准品溶液，优化去簇电压和碰撞电压，得到离子丰度较大的碎片离子为该化合物裂解的主要碎片离子。表1为ESI模式下，各化合物的主要碎片离子的质荷比。MRM模式下防腐剂、抗氧化剂、以及甜味剂标准溶液的选择离子流图见图5，MRM模式下油溶性色素标准溶液的选择离子流图见图6。

2.4 方法的线性方程和检出限

配制混合标准系列工作液， 质量浓度为0.25～250μg/L(其中TBHQ为500～2000μg/L)的系列混合标准工作溶液，以目标组分的峰面积为y轴，对应的质量浓度为x轴，绘制标准曲线。各种添加剂和非法添加物在以上质量浓度范围内具有良好的线性关系，线性相关系数均大于0.983。回收率和精密度的测定通过向空白油样中添加质量浓度水平A类化合物为10μg/L，B类化合物为100μg/L的添加剂混合标准溶液来进行，每个质量浓度样品平行分析5次。各化合物回收率在78.2%～108.3%之间，相对标准偏差为0.9%～17.7%。结果见表2。

2.5 市售样品检测

图 7 阳性样品的MRM色谱图Fig.7 MRM chromatogram of positive sample

配对北京市市售的37种品牌的食用植物油和调味油进行测定，其中包括有6种植物调和油、10种芝麻油、3种橄榄油、7种花椒油、6种辣椒油和5种其他调味油。实验测定37种调味油中有5种含有抗氧化剂TBHQ，含量分别是54.1、44.8、35.0、14.4mg/L和4.0mg/L，含量均低于我国限量要求。样品的谱图见图7。TBHQ是我国食用植物油中常规使用的抗氧化剂。

3 结 论

在本实验建立了食用植物油和调味油中27种食品添加剂和非法添加物的高效液相色谱-串联质谱检测方法。该方法快速、准确、灵敏度高。方法的精密度，线性关系和检测限均满足目标物分析的要求，可用于我国分析实验室的食品安全相关检测。

[1] 彭亚锋, 巢强国, 葛宇, 等. 食品添加剂检测技术的研究进展[J]. 粮油加工, 2009(10)： 138-140.

[2] 刘永强, 董静, 宫小明. 食品添加剂检测技术与方法研究进展[J]. 畜牧与饲料科学, 2009, 30(1)： 153-155.

[3] 张斌. 生物传感器在食品检测中的应用[J]. 中国食物与营养, 2005(3)： 29-30.

[4] 涂顺, 裘雪梅, 谢少霞, 等. 苏丹红Ⅰ酶联免疫吸附检测方法的建立[J].食品与生物技术学报，2009(6)： 791-794.

[5] BOYCE M C. Simultaneous determination of antioxidants, preservatives and sweeteners permitted as additives in food by mixed micellar electrokinetic chromatography[J]. Journal of Chromatography A,1999, 847(1/2)： 369-375.

[6] 李群, 邵雪阳. 离子色谱法检测面制品中溴酸钾[J]. 预防医学杂志, 2006, 40(2)： 116-117.

[7] G O N Z A L E Z M, G A L L E G O M, V A C A R C E L M. G a s chromatographic flow method for the preconcentration and simultaneous determination of antioxidant and preservative additives in fatty food[J]. Journal of Chromatography A, 1999, 848(1/2)： 529-536.

[8] 吴敏, 林建忠, 邹伟, 等. 高效液相色谱法同时测定食品中对位红和苏丹色素等8种脂溶性染料[J]. 分析测试学报, 2006(3)： 74-76.

[9] 刘丽, 彭名军, 郑志伟, 等. UPLC法同时测定食品中5种添加剂[J]. 现代预防医学, 2010, 37(12)： 2318-2320.

[10] 鞠福龙, 李东刚, 李春娟. GC-MS-SIM法同时分析饮料中防腐剂和抗氧化剂[J]. 现代科学仪器, 2010(1)： 77-80.

[11] 李春娟, 鞠福龙, 李东刚. GC-MS/MS法同时检测葡萄酒中10种防腐剂和抗氧化剂[J]. 中国酿造, 2009(6)： 149-152.

[12] LI Xiuqin, JI Chao, SUN Yanyan, et al. Analysis of synthetic antioxidants and preservatives in edible vegetable oil by HPLC/TOFMS[J]. Food Chemistry, 2009, 113(2)： 692-700.

[13] 姚浔平, 李小平, 陈晓红, 等. 离子排阻色谱法测定啤酒和饮料中有机酸研究[J]. 中国卫生检验杂志, 2008, 18(5)： 801-803.

[14] MEYER L. Quantification of synthetic phenolic antioxidant in dry foods by reversed-phase HPLC with photodiode array detection[J]. Food Chemistry, 2002, 77(1)： 93-100.

[15] 陈玉波, 赵接红, 于伟. 液相色谱法同时测定酱腌菜食品中九种食品添加剂含量[J]. 食品科技, 2010, 35(12)： 304-307.