汪 璇，张建新*，孙长江，汪晓玉

(西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100)

黄粉虫(Tenebrio molitor Linnaeus)又称大黄粉虫、黄粉甲，俗称“面包虫”。隶属于昆虫纲(Insecta)、鞘翅目(Coleoptera)、拟步甲科(Tenebrionidae)、粉甲属(Tenebrionini)[1]。世界性分布，原产于美洲，20世纪50年代由前苏联传入我国[2]。现广泛分布于我国的黑龙江、辽宁、甘肃、陕西、四川、山东、湖北等省区[3]。黄粉虫含有丰富的蛋白质、脂肪、维生素、甲壳素、多糖、矿物质等多种营养成分。黄粉虫干粉的蛋白质含量在48%～54%之间，不饱和脂肪酸含量较高[4]。

黄酮类化合物是自然界中存在的一大类天然多酚化合物，广泛存在于水果、蔬菜、坚果、谷物、茶、酒、蜂胶等膳食中[5]。黄酮类化合物具有抗癌、防止心血管疾病、抗氧化、清除自由基[6]、抗病毒、抑菌[7]等生物活性作用。目前，国内外对植物体内黄酮类化合物的报道很多[8-9]，而昆虫体内黄酮类化合物的报道较少。近年来，对于黄粉虫的研究，主要涉及蛋白质[10]、抗氧化肽[11]、抗菌肽[12]、油[13]、壳聚糖[14]、多糖[15]的提取，但对于黄粉虫黄酮类化合物的提取还未见研究报道。本实验采用超声波水提取黄粉虫黄酮，并应用响应面法优化提取工艺，旨在确定黄粉虫黄酮提取工艺参数。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄粉虫 陕西秦虫黄粉虫科技发展有限公司；芦丁标准品(纯度≥95%) 国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇、石油醚、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠(均为分析纯)。

1.2 仪器与设备

KQ-600DB型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器 郑州长城精工仪器有限公司；UV-2550型紫外分光光度计 日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 黄粉虫黄酮提取工艺流程

黄粉虫烘干样品→破碎→石油醚脱脂8h→粉碎过筛40目→超声波水浸提→抽滤→定容→测定黄酮提取量

1.3.2 标准溶液的配制

称取干燥至质量恒定的芦丁标准品10mg，用80%乙醇溶液溶解，转移至50mL容量瓶中定容，此标准溶液质量浓度为0.2mg/mL。

1.3.3 黄粉虫黄酮鉴定和波长的选择

取1mL上述标准溶液于10mL具塞刻度试管中，加80%乙醇溶液至5mL，加5%亚硝酸钠溶液0.3mL，摇匀后静置6min；加10%硝酸铝溶液0.3mL，摇匀后静置6min；加入1.0mol/L氢氧化钠溶液4mL，加80%乙醇溶液至刻度，摇匀后静置15min；在400～700nm波长之间测定吸光度。

称取5.0g脱脂黄粉虫粉至三角瓶中，加入100mL蒸馏水，在温度60℃、超声功率360W条件下超声30min。抽滤后，吸取1mL提取液于10mL具塞刻度试管中。按上述方法在400～700nm波长之间测定吸收光谱。如图1所示，结果表明芦丁标准溶液与样品溶液均在510nm左右有最大吸收峰值，可知提取液中含有黄酮类化合物。因此，波长确定为510nm。

图 1 标准液与样品液光谱扫描图Fig.1 Absorption spectra of rutin standard solution and sample solution

1.3.4 标准曲线的制作

分别量取标准溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于10mL具塞刻度试管中，以下同1.3.3节的实验步骤。在510nm的波长处测定吸光度(A)，得标准曲线的回归方程为：A＝10.39C－0.011(C为质量浓度/(mg/mL)；A为吸光度；决定系数R2＝0.9996)。

1.3.5 黄粉虫黄酮的测定

准确称取1.0g脱脂黄粉虫粉至三角瓶中，按照要求加入一定量的提取剂，在一定温度、功率下超声浸提一定时间，抽滤，滤液用提取剂定容于100mL的容量瓶中，作为待测液。

取1mL待测液于10mL具塞试管中，按标准曲线的测定方法和步骤于510nm波长处测定吸光度，根据标准曲线方程计算样品中黄酮的提取量(mg/g)。

1.4 Box-Behnken试验设计

在单因素试验结果的基础上，对液料比、超声时间、浸提温度和超声功率4个影响黄粉虫黄酮提取量的主要因素进行优化试验。采用四因素三水平Box-Behnken试验优化工艺条件。试验设计与统计分析软件为Desigh-Expert 7.0 Trial。试验因素水平设计见表1。

表 1 响应面分析因素与水平表Table1 Variables and their coded levels used in response surface analysis

2 结果与分析

2.1 提取剂的选择

称取2g脱脂黄粉虫粉于三角瓶中，依次加入60mL蒸馏水，10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液。在浸提温度65℃、超声功率420W条件下超声40min。减压抽滤，定容于100mL的容量瓶中，测定黄粉虫黄酮提取量，结果如图2所示。结果表明，蒸馏水对黄粉虫黄酮的提取效果更好，利用不同体积分数的乙醇溶液提取黄粉虫黄酮的效果随乙醇体积分数的增大而依次降低。加之，水提取成本低，无污染，效率高，而乙醇溶液提取成本高，安全性低，还可能造成环境污染。因此，本实验选用蒸馏水作为提取剂来提取黄粉虫黄酮。

图 2 提取剂对黄酮提取量的影响Fig.2 Effect of extraction solvents on the yield of fl avonoids from Tenebrio molitor

2.2 黄粉虫黄酮提取单因素试验

2.2.1 液料比对黄粉虫黄酮提取量的影响

称取5份1g脱脂黄粉虫粉，分别加入10、20、30、40、50mL蒸馏水，在浸提温度60℃、超声功率420W的条件下超声提取40min，结果见图3。结果表明，黄粉虫黄酮提取量随液料比的增大而呈先上升后下降的趋势，当液料比为20：1(mL/g)时，黄酮提取量达最大值。这可能是因为提取剂用量越多，脱脂黄粉虫粉与水接触得越充分，所以黄酮的提取量呈上升趋势。但是在一定的超声条件下，液料比越大，溶质所受的机械剪切力越小。综合考虑，液料比定为10：1～30：1。

图 3 液料比对黄酮提取量的影响Fig.3 Effect of liquid-to-solid ratio on the yield of fl avonoids from Tenebrio molitor

2.2.2 超声时间对黄粉虫黄酮提取量的影响

称取5份1g脱脂黄粉虫粉，加入20mL蒸馏水，在浸提温度60℃、超声功率420W条件下分别超声提取10、20、30、40、50min，结果见图4。结果表明，黄粉虫黄酮的提取量随时间的延长呈先上升后降低的趋势，当提取时间为40min时，提取量最大。这可能是因为随时间的延长，黄酮的溶出率逐渐增加，但提取时间越长，杂质的溶出量也相应增加，而提取量反而下降，因此提取时间为50min时，提取量迅速降低[16]。综合考虑，提取时间定为20～40min。

图 4 超声时间对黄酮提取量的影响Fig.4 Effect of extraction time on the yield of fl avonoids from Tenebrio molitor

2.2.3 浸提温度对黄粉虫黄酮提取量的影响

称取5份1g脱脂黄粉虫粉，加入20mL蒸馏水，分别在浸提温度为40、50、60、70、80℃，超声功率420W的条件下超声提取30min，结果见图5。结果表明，黄粉虫黄酮提取量随温度的升高呈先上升后下降的趋势，当温度达到50℃时提取量最大。这可能是因为，温度升高有利于黄酮的溶出，但温度过高，引起黄酮物质结构发生变化，破坏黄酮物质[17]。综合考虑，提取温度定为50～70℃。

图 5 浸提温度对黄粉虫黄酮提取量的影响Fig.5 Effect of extraction temperature on the yield of fl avonoids from Tenebrio molitor

图 6 超声功率对黄酮提取量的影响Fig.6 Effect of ultrasonic power on the yield of fl avonoids from Tenebrio molitor

2.2.4 超声功率对黄粉虫黄酮提取量的影响

称取5份1g脱脂黄粉虫粉，加入20mL蒸馏水，在浸提温度50℃，分别在超声功率300、360、420、480、540W条件下超声提取40min，结果见图6。结果表明，黄粉虫黄酮提取量随超声波功率的增加呈先上升后下降的趋势。当超声功率为360W时，提取量最大。这可能是因为，随着超声功率的增大，机械剪切力使黄酮逐渐溶出，但超声功率过大，引起黄酮结构发生变化。同时，一些能使黄酮类化合物降解的酶也被释放出来，从而提取量逐渐降低[18]。综合考虑，提取功率定为300～420W。

2.3 黄粉虫黄酮提取工艺优化

2.3.1 黄粉虫黄酮提取量的方差分析

采用Design-Expert 7.0 Trial软件，按照Box-Behnken组合设计，依据单因素试验结果选取液料比、超声时间、浸提温度、超声功率4因素作为自变量，以黄粉虫黄酮提取量作为响应值。试验设计方案及数据处理结果见表2，方差分析结果见表3。

表 2 Box-Behnken 设计方案及响应值结果Table 2 Box-Behnken experimental design and corresponding results

对表2结果进行统计分析，可建立如下二次回归方程(编码方程)：

表 3 响应面二次模型方差分析(Ⅰ)Table 3 Analysis of variance of the original quadratic regression model for the yield of flavonoids

从表3分析得出，该二次回归方程的模型项、二次项A2、B2都表现出极显著影响，一次项B、D，二次项C2、D2，交互项AD、BD都表现出显著影响，而且失拟项不显著，表明该模型有显著意义。为了简化二次回归方程，剔除偏回归系数不显著的AB、BC、CD项，可建立如下二次回归方程(编码方程)：

表 4 响应面二次模型方差分析(Ⅱ)Table 4 Analysis of variance of the simplififi ed quadratic regression model for the yield of flavonoids

由表4分析得出，剔除不显著项后，该模型的F值由5.76变为7.20，表明经简化后，该模型更显著，而且交互项及二次项影响显著，失拟项不显著，模型预测值和实际值拟合较好。由P值可知，在各因素所选的范围内，对黄酮提取量影响的大小依次为B(超声时间)＞D(超声功率)＞A(液料比)＞C(浸提温度)。经Design-Expert 7.0 Trial 软件分析得到，回归方程的相关系数R2为0.8234，由此可知，液料比、超声时间、浸提温度、超声功率对黄酮提取量的影响不是简单的线性关系。变异系数为2.32%，说明该模型的精密度较好。综上所述，建立的回归方程能代替试验真实点来解释响应结果。

2.3.2 响应面分析

等高线的形状反映交互效应的强弱大小，圆形表示两因素交互作用不显著，而椭圆形则表示两因素交互作用显著[19]。图7、8可知，液料比与超声功率(AD)、超声时间与超声功率(BD)的交互作用对黄粉虫黄酮的提取量影响显著。同时，由两组图可知，在所选范围内存在极值点，即响应面最高点，也是等高线最小椭圆的中心点(5点)。

图 7 液料比和超声功率交互作用对黄酮提取量的影响Fig.7 Response surface and contour plots showing the effect of liquidto-solid ratio and ultrasonic power on the yield of fl avonoids

图 8 超声时间和超声功率交互作用对黄酮提取量的影响Fig.8 Response surface and contour plots showing the effect of ultrasonic treatment time and power on the yield of fl avonoids

图7表示超声时间为30min，浸提温度为50℃时，液料比与超声功率对黄酮提取量的影响。当超声功率一定时，黄酮提取量随液料比增大先增大后减小，当液料比小于18：1(mL/g)时，黄酮提取量逐渐增大；当液料比一定是，黄酮提取量随超声功率的增加而增大，当大于380W时，趋于缓和。

图8表示液料比20：1(mL/g)，超声温度50℃时，超声时间和超声功率对黄酮提取量的影响。当超声功率一定时，黄酮提取量随超声时间的延长先增大后逐渐减小，在超声时间为30min之前，黄酮提取量逐渐增加；当超声时间一定时，黄酮提取量随超声功率的增加而增大，当功率达380W时，趋于缓和。

由Design-Expert 7.0 Trial软件分析可知，超声波辅助提取黄粉虫黄酮的最优工艺参数为液料比18.34：1(mL/g)、超声时间30.06min、浸提温度58.43℃、超声功率380.62W，在此优化条件下，黄粉虫黄酮提取量的理论值11.58mg/g。结合实际试验条件，最终选择的实验条件为液料比18：1(mL/g)、超声时间30min、浸提温度58℃、超声功率380W。经验证，得实际测得黄粉虫黄酮提取量为11.47mg/g，与理论值基本一致，说明该方程与实际情况拟合很好，证明应用响应面优化条件来提高黄粉虫黄酮提取量的方法可行。

3 结 论

本实验采用响应面法对超声波水提取黄粉虫黄酮工艺进行优化，建立的二次多项式数学模型具有良好的显著性。提取黄粉虫黄酮的最佳工艺条件为液料比18.34：1(mL/g)、超声时间31.06min、浸提温度58.43℃、超声功率380.62W，理论预测值为11.58mg/g，实际测量值为11.47mg/g。4种因素的影响大小依次为超声时间、超声功率、液料比、浸提温度。超声波水提取黄粉虫黄酮，降低了生产成本，是一种安全、经济和高效的提取方法。

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