胡庆辉，王程栋，王树声*，李湘伟，侯 娜，王浩浩，李 斌

（1.农业部烟草类作物质量控制重点开放实验室，中国农业科学院烟草研究所，青岛 266101；2.中国农业科学院研究生院，北京 100081）

多酚物质是烤烟中重要的香气前体物，烟叶中某些酚类物质的含量与烟叶品质及其芬香吸味成正相关，与烟叶等级密切联系，常被作为优质烟化学成分考核指标之一[1]。烟叶中的酚类化合物主要包括单宁类、香豆素类、黄酮类、花色素类、简单酚衍生物等，其中绿原酸、芸香苷和莨菪亭是烟草中最主要的酚类物质[2]。有关研究表明，烟叶中多酚类物质的含量受众多栽培环境条件的影响，如季学军等[3]报道，皖南地区粉砂土、河滩地砂壤土和冲积砂壤土植烟中部叶多酚含量高于水稻黏土；赵铭钦等[4]认为，培土成垄和分次施钾可以明显增加烟叶中总酚、绿原酸、芸香苷、石油醚提取物含量；王毅等[5]研究发现，在一定范围内增加 UV-B辐射强度，烟草总多酚含量变化不大，但辐射强度过高可提高烟叶总多酚含量。盐胁迫是目前对农业生产影响较大的非生物胁迫因子之一，目前有关 NaCl胁迫对烤烟栽培品种多酚物质含量影响的报道较少。本研究试图探讨分析NaCl胁迫下烟草多酚物质及相关酶活性的变化规律，为研究逆境胁迫下的多酚物质的调控机制提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试烤烟品种为NC89。温室播种育苗，幼苗3片真叶假植，五叶一心时进行砂培盆栽，每盆装填石英砂15 kg，定期浇Hoagland营养液，植株生长至中心花开放期打顶，打顶后8 d，进行NaCl胁迫处理。

胁迫处理在1/3 Hoagland营养液中设350、700和0mmol/L（CK）3个NaCl处理浓度，3次重复。

胁迫处理后 0、2、4、6、8 d，分别取植株下部叶片（从下至上第 4片），剪取叶片中部不含明显叶脉的叶肉样品，置于CHRIST冷冻干燥机干燥。

1.2 测定方法

多酚氧化酶（PPO）活性测定参照文献[6]的方法，测定波长为525 nm；苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性测定参照陈毓荃方法[7]；绿原酸、芸香苷含量测定参照文献[8]；类黄酮和花青苷含量测定采用Pirie[9]和王惠聪[10]的方法，以 U=OD600nm-OD553nm表示花青苷含量。

1.3 数据分析

采用DPS 7.05软件进行相关性分析。

2 结 果

2.1 NaCl胁迫下烤烟叶片绿原酸含量变化

由图1看出，NaCl胁迫处理前4 d，绿原酸含量与对照差异不明显，处理4 d后，含量开始增加，处理8 d时，达到最大值，平均比对照高25.60%。不同 NaCl浓度胁迫下，随处理时间的延长，叶片绿原酸含量变化趋势相似，其中胁迫处理6 d时含量接近，胁迫8 d时350mmol/L处理烟叶绿原酸含量明显高于700mmol/L。由此表明，烤烟新鲜叶片中绿原酸含量随 NaCl胁迫时间的延长，在胁迫后期逐渐增加，以350mmol/L处理增幅较大。

图1 NaCl胁迫下鲜烟叶绿原酸含量变化Fig.1 Changes of chlorogenic acid contents of fresh tobacco leaves under NaCl stress

2.2 NaCl胁迫下烤烟叶片芸香苷含量变化

由图2看出，350mmol/L NaCl处理下，叶片芸香苷含量在胁迫后2 d略增加，处理4、6 d含量与对照接近，胁迫8 d时含量明显上升，比对照增加12.02%。与对照相比，700mmol/L处理下芸香苷含量在胁迫前期略低，后期略高，但差异都不明显。可以看出，不同 NaCl浓度胁迫下，叶片芸香苷含量变化趋势有较大差异，350mmol/L处理芸香苷含量在胁迫后期增加，而700mmol/L处理芸香苷变化不大。

图2 NaCl胁迫下新鲜烟叶芸香苷含量的变化Fig.2 Changes of rutin contents of fresh tobacco leaves under NaCl stress

2.3 NaCl胁迫下烤烟叶片类黄酮含量变化

由图3看出，350mmol/L胁迫处理2 d时类黄酮含量迅速上升，比对照增加16.67%，4、6 d时含量回落，与对照差异不显著，处理8 d含量快速上升，比对照高33.54%。700mmol/L胁迫处理类黄酮含量呈先略降低再平缓增加。不同 NaCl浓度胁迫下，叶片类黄酮含量变化差异较大，胁迫2、8 d时，350mmol/L处理类黄酮含量均明显高于 700mmol/L。NaCl胁迫的浓度及时间都对类黄酮含量变化有明显影响，其中350mmol/L胁迫处理类黄酮含量随处理时间延长呈“增加-降低-增加”的变化趋势。

图3 NaCl胁迫下新鲜烟叶类黄酮含量变化Fig.3 Changes of flavonoid contents of fresh tobacco leaves under NaCl stress

2.4 NaCl胁迫下烤烟叶片花青苷含量变化

由图4看出，对照条件下，叶片花青苷含量缓慢增加。处理2 d时，350mmol/L NaCl处理花青苷含量明显增加，高于对照28.95%，700mmol/L处理花青苷含量下降。随后350、700mmol/L胁迫处理含量变化趋势相似，均随处理时间延长，先缓慢降低，再迅速下降，700mmol/L处理6 d时比对照降低80.83%，350mmol/L处理8 d时花青苷含量也大幅下降。不同NaCl浓度胁迫下，350mmol/L胁迫花青苷含量均明显高于700mmol/L处理。

2.5 NaCl胁迫下烤烟叶片PAL活性变化

图4 NaCl胁迫下新鲜烟叶花青苷含量变化Fig.4 Change of anthocyanin contents of fresh tobacco leaves under NaCl stress

图5 NaCl胁迫下鲜烟叶苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性变化Fig.5 Changes of phenylalanine ammonia lyase (PAL)activity of fresh tobacco leaves under NaCl stress

由图5可知，350mmol/L NaCl胁迫下叶片PAL活性随处理时间的延长而逐渐增加，其中处理 8 d时增幅最大，活性是对照的2.44倍，处理2 d时增幅次之。700mmol/L胁迫下PAL活性先降低，胁迫4 d时活性降幅最大，比对照下降42.95%，随后逐渐上升，但均低于对照。可见，NaCl胁迫浓度对PAL活性变化有明显影响，350mmol/L NaCl胁迫后PAL活性明显高于700mmol/L NaCl胁迫，其中处理8 d时两者活性差异最大。

2.6 NaCl胁迫下烤烟叶片PPO活性变化

NaCl胁迫下新鲜烟叶多酚氧化酶（PPO）活性变化如图6。在对照条件下，PPO活性先一定幅度下降，再平稳增加，最后与处理前接近。350、700mmol/L NaCl胁迫下PPO活性变化趋势一致，分别随胁迫时间的延长而增加，胁迫2 d时增幅最大，随后增幅逐渐减小。350mmol/L NaCl胁迫在处理前4 d活性略高于700mmol/L，4 d后两者接近。

2.7 NaCl胁迫下多酚物质与PAL、PPO相关性分析

从表1可知，350mmol/L NaCl胁迫处理后，PAL活性与绿原酸在0.01水平上极显著正相关，相关系数0.95，与芸香苷在0.05水平上显著正相关，相关系数0.82，700mmol/L NaCl胁迫处理下，PAL活性与绿原酸、芸香苷相关系数减小。PPO活性与绿原酸在350、700mmol/L NaCl胁迫下呈正相关关系，接近显著水平，与类黄酮、芸香苷含量的关系不明确，与花青苷在700mmol/L NaCl胁迫处理下显著负相关，相关系数-0.84。

图6 NaCl胁迫下新鲜烟叶多酚氧化酶（PPO）活性变化Fig.6 Changes of polyphenol oxidase (PPO) activity of fresh tobacco leaves under NaCl stress

表1 多酚物质含量与PAL、PPO活性相关系数Table 1 Correlations between polyphenols contents and PAL,PPO activities

3 讨 论

多酚是一类广泛存在于植物体内的次生代谢物，被认为是植物抵抗不良环境因素的物质之一。Kasai等[11]研究了多种植物的抗氧化机理，认为绿原酸可抑制DNA受到活性氧攻击时8-OH-dG的形成。Koeppe等[12]发现低温可促进绿原酸含量的增加。本研究发现，NaCl胁迫后期绿原酸含量增加，以700mmol/L NaCl胁迫增幅较小，可能因为严重的胁迫会将绿原酸氧化形成其他物质[13]。

芸香苷是烤烟类黄酮中含量较大的物质之一，NaCl胁迫处理下芸香苷、类黄酮含量变化趋势相似。蔡娜等[14]认为，干旱胁迫可以增加荞麦总黄酮和芦丁含量。类黄酮含量受胁迫程度的明显影响，350mmol/L NaCl胁迫2 d时，含量增加，之后含量下降，NaCl处理浓度增大时，类黄酮含量则明显降低，与前人研究 NaCl胁迫紫叶李叶片的研究结果一致[15]。董新纯等[16]也报道，增强UV-B处理后苦荞叶片类黄酮含量与逆境伤害程度相关。350mmol/L NaCl胁迫8 d时，芸香苷、类黄酮含量明显增加，可能与其合成过程中的关键酶PAL活性大幅提高有关。

盐胁迫可诱导拟南芥突变体花青苷积累，提高植株清除活性氧及抵御逆境的能力[17]，同时紫外光辐射、低温和干旱胁迫也可增加花青苷含量，抵御环境胁迫[18]。本研究中350mmol/L NaCl胁迫前2 d，花青苷快速增加，之后积累量不断下降，700mmol/L NaCl处理时花青苷含量持续降低。花青苷是由花青素和糖组成的糖苷，胡晓丽[15]认为，花青苷含量的下降是受到可溶性糖降低的影响。

PAL作为苯丙烷类代谢途径的关键酶和限速酶，在土壤干旱胁迫下与紫叶矮樱叶片类黄酮正相关极显著，PAL活性提高能促进类黄酮的合成[19]。350mmol/L NaCl胁迫条件下，PAL活性上升，与绿原酸、芸香苷的相关性分别达到极显著、显著，但700mmol/L NaCl胁迫下，这种相关关系明显减弱。这说明该NaCl胁迫下PAL活性的增加促进绿原酸、芸香苷的合成，但过高浓度 NaCl胁迫时绿原酸、芸香苷的积累主要受其他酶或氧化伤害的影响。

PPO可在烘烤过程中氧化多酚物质形成醌，但在非生物胁迫中与多酚的关系报道较少。NaCl胁迫下，PPO活性逐渐上升，与绿原酸呈一定的正相关，但与类黄酮、芸香苷关系不明确，说明 NaCl胁迫条件下绿原酸的积累除了受其合成机制的影响，还与PPO活性有关。

4 结 论

350mmol/L NaCl胁迫处理可明显的增加烤烟叶片中多酚物质（类黄酮、芸香苷、花青苷、绿原酸）含量及PAL活性，但700mmol/L NaCl胁迫时除绿原酸在处理6 d开始小幅增加外，类黄酮、花青苷含量及PAL活性均明显下降，可见多酚物质含量及PAL活性的变化在不同浓度NaCl胁迫下有较大差异。PAL活性与多酚物质含量的相关性也受胁迫浓度的影响，350mmol/L处理时PAL活性分别与绿原酸、芸香苷含量呈极显著、显著正相关，这说明其与多酚物质含量变化有密切联系，但此相关性在700mmol/L胁迫时明显减弱。NaCl胁迫处理下，PPO活性逐渐升高，对绿原酸含量变化有一定影响。从以上结果来看，探讨 NaCl胁迫下多酚物质含量及相关酶活性的变化，也可作为一种研究酚类物质调控的方法。

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