王淑兰,倪光夏,2



针刺督脉经穴对局灶性脑缺血再灌注大鼠缺血半暗带MAP-2、NF-L的mRNA表达的影响

王淑兰1,倪光夏1,2

(1.南京中医药大学第二临床医学院,南京 210029;2.江苏省第二中医院,南京 210017)

观察针刺督脉经穴对脑缺血再灌注大鼠缺血半暗带神经细胞骨架结构微管相关蛋白MAP-2和神经微丝蛋白NF-L的mRNA表达的影响,并探讨其可能的作用机制。以针刺督脉经穴为干预手段,以大鼠急性局灶性脑缺血再灌注模型作为研究对象,运用SYBR Green实时定量PCR观测脑缺血再灌注后缺血半暗带MAP-2和NF-L的mRNA表达变化,并观察针刺对上述指标的调节作用规律。针刺组和对照组MAP-2和NF-L的mRNA表达较模型组均显著升高(＜0.01),且针刺组升高更显著(＜0.05)。针刺督脉经穴能上调MAP-2和NF-L的mRNA表达,促进神经元树突和轴突的出芽和再生,提高神经元的可塑性,可能是针刺督脉经穴发挥神经保护作用的机制之一。

针刺;电针;脑缺血再灌注;大鼠;PCR

脑梗死(Cerebral Infarction)是由于脑部血流供应障碍,缺血、缺氧引起的局灶性脑组织的缺血性坏死或软化。其发病率、病死率、致残率和复发率均较高,不仅严重影响患者的生活质量,而且为社会和家庭带来沉重的经济和心理负担,探寻有效的治疗方法一直是医学领域的研究方向。本实验应用线栓法制备大鼠局灶性脑缺血与再灌注模型,通过针刺督脉经穴,观察神经细胞微管相关蛋白MAP-2和神经微丝蛋白NF-L 的mRNA表达变化,进一步探讨针刺保护脑缺血后神经细胞损伤的作用机制。

1 材料和方法

1.1 动物与分组

清洁级雄性SD大鼠40只,体重(150±10)g,购自上海西普尔-必凯实验动物有限责任公司[动物许可证号:SCXK(沪)2008-0016],饲养于南京中医药大学实验动物中心。按随机数字表法分为正常组、假手术组、缺血再灌注模型组(模型组)、针刺督脉经穴组(针刺组)、针刺阳明经穴组(对照组),共5组,每组8只。

1.2 主要仪器及试剂

韩氏LH402A穴位神经电刺激仪,核酸蛋白测定仪(Eppendorf公司),基因扩增仪MJ-mini(BIO-RAD公司),实时定量PCR仪Mx3000P(Stratagene公司),总RNA提取试剂RNAiso Plus(Takara公司),反转录试剂盒PrimeScript RT Master Mix(Takara公司),SYBR Premix Ex Taq(Takara公司)。

1.3 模型制备

参照Longa[1]线栓法并加以改进。SD大鼠用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g体重i.p)麻醉,仰卧固定。常规消毒后,于颈部正中切开,钝性分离右侧颈总动脉(common carotid artery,CCA)、颈外动脉(external carotid artery,ECA)、颈内动脉(internal carotid artery,ICA)。结扎ECA远心端,用微型动脉夹夹住CCA近心端及ICA,在靠近CCA分叉处用眼科剪在ECA上剪一小口,将直径0.235 mm的尼龙钓丝用火烤成小球的一端沿小切口插入ECA,剪断ECA远心端,将ECA反向拉直,使其与ICA处于同一直线上,移去ICA的动脉夹,经CCA分叉处将钓丝缓慢向ICA入颅脑内的方向推进约17～18 mm,微遇阻力时停止,使钓丝头端到达较细的大脑中动脉起始处。缚紧预先放置于穿刺小切口处的丝线,缝合,消毒,于缺血2 h后拔出栓线,建立缺血再灌注模型。假手术组大鼠只分离暴露CCA、ECA、ICA,结扎ECA。正常组不进行手术处理。

参考Bederson6级5分法。正常为5级(0分);对侧上肢不能完全伸展为4级(1分);向对侧推时抵抗力下降为3级(2分);提尾时向对侧转圈为2级(3分);自动转圈为1级(4分);无自发性活动、意识障碍为0级(5分)。对再灌注后大鼠即刻进行神经行为学评分,达到1～4分视为造模成功。之后观测缺血再灌注24 h后各组大鼠神经行为学评分以明确其变化。

1.4 治疗方法

取穴根据中国针灸学会实验针灸研究会制定的“动物针灸穴位图谱”选取相应穴位。针刺组取穴以督脉经穴为主,取水沟、百会、风府、大椎。在动物模型制备成功1 h时进行1次针刺。选用苏州医疗用品厂有限公司出品的0.30 mm×13 mm针灸针进行治疗。水沟直刺深度为0.2寸;百会向后呈15°平刺,采用快速捻转的手法2 min;风府、大椎穴直刺0.2～0.3寸,1 min/穴/次,行平补平泻。此外,分别对水沟、百会,风府、大椎通韩氏LH402A穴位神经电刺激仪,频率为2 Hz,强度为2 mA。

1.5 标本处理

确认各组模型已建立。于造模后24 h断头处死动物,快速取脑,取病变侧,将缺血中心坏死区、嗅球及小脑去掉,取缺血坏死区周围的缺血半暗带,迅速放入液氮中冷冻,稍后置于﹣80℃超低温冰箱保存备用。

1.6 脑组织MAP-2、NF-L的mRNA表达检测

运用SYBR Green实时定量PCR检测方法检测脑组织中MAP-2、NF-L的mRNA表达。

1.6.1 总RNA制备

脑组织100～200 mg,分别加入1 mL RNAiso Plus,按试剂说明书中操作步骤进行RNA提取。使用Eppendorf公司的核酸蛋白测定仪检测抽提总RNA的质量和浓度。要求A260/A280比值约2.0,并计算RNA含量。

1.6.2 cDNA合成

反应体系30mL。取5×PrimeScript Buffer(含有PrimeScript RTase、RNase Inhibitor、Random 6 mers、Oligo dT Primer、反应Buffer)6mL,每一标本取总RNA 1.5mg,加RNase Free dH2O至30mL。37℃ 15 min,85℃ 5 s进行逆转录。

1.6.3 引物

MAP-2和NF-L基因使用引物设计软件primer5.0,分别参照GeneBank序列号NM_013066.1和NM_031783.1跨内含子设计,大连Takara合成。MAP-2上游引物为CAGAACAAACAGCTGCACTGGA(方向为5’to 3’);下游引物为TCTAAAGGCTCAGCGAATGAGGA(5’to 3’)。NF-L上游引物为CCATCAGCAACGACCTCAAGTCTA (5’to 3’);下游引物为CGGCTTCCAGGACCTTGTTC(5’to 3’)。b-actin作为内参。

1.6.4 SYBR Green实时定量PCR

25mL的反应体系中包括:SYBR Premix Ex Taq(内含Takara Ex Taq HS, dNTP Mixture,Mg2﹢,Tli RNaseH,SYBR GreenⅠ等) 12.5mL;上下游引物各5mL(1mmol);ROX Reference DyeⅡ(用于校正孔与孔之间的荧光信号误差)0.5mL; cDNA标本2mL。反应体系加入实时定量PCR仪Mx3000P (Stratagene公司)进行PCR扩增。两步法PCR扩增,预变性反应条件为95℃ 30 s,1Cycle;PCR反应为95℃ 5 s,60℃ 20 s,40 Cycle。将检测的临界点设定在PCR扩增过程中,荧光信号由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环数(threshold cycle,Ct)值处。

1.7 统计学方法

采用SPSS17.0对数据资料进行统计分析。计量数据用均数±标准差表示,多组间比较采用完全随机设计的单因素方差分析,组间比较方差齐时选择LSD法。同组间治疗前后比较采用配对检验,差值d不服从正态分布时选择非参数检验。以＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠行为学评分比较

由表1可见,模型组、针刺组、对照组大鼠神经功能评分与正常组和假手术组比较,差异均具有统计学意义(＜0.05)。针刺组、对照组治疗前大鼠神经功能评分与模型组比较,差异均无统计学意义(＞0.05)。针刺组、对照组治疗后大鼠神经功能评分与模型组比较,差异均具有统计学意义(＜0.01)。针刺组、对照组治疗后大鼠神经功能评分与同组治疗前比较,差异均具有统计学意义(＜0.05)。针刺组治疗后大鼠神经功能评分与对照组比较,差异具有统计学意义(＜0.05)。

表1 各组大鼠神经功能评分比较 (±s,分)

注:与正常组、假手术组比较1)＜0.05;与模型组比较2)＜0.01;与对照组比较3)＜0.05;同组内治疗前比较4)＜0.05

2.2 各组MAP-2、NF-L的mRNA水平比较

采用b-actin作为内参,利用样本MAP-2、NF-L与b-actin的mRNA含量的比值,作为评价MAP-2和NF-L的mRNA相对表达水平的指标。以2﹣△△Ct法表示相对定量结果。根据公式△Ct=[Ct(MAP-2或NF-L)]－[Ct(b-actin)]、△△Ct=[△Ct(实验组))－[△Ct(正常组)],2﹣△△Ct表示实验组MAP-2或NF-L相对于正常组原始拷贝数的倍数差异,即表示MAP-2或NF-L在两组表达的相对变化。

表2 各组MAP-2、NF-L的mRNA水平比较 (±s)

注:与正常组比较1)＜0.01;与模型组比较2)＜0.01;与对照组比较3)＜0.05

由表2可见,正常组大鼠脑组织中有少量MAP-2和NF-L的mRNA表达。假手术组MAP-2和NF-L的mRNA表达与正常组比较,差异均无统计学意义(＞0.05)。模型组MAP-2和NF-L的mRNA表达较正常组明显下降(＜0.01)。与模型组比较,针刺组和对照组MAP-2和NF-L的mRNA表达均上调(＜0.01),且与对照组比较,针刺组上调更为显著(＜0.05)。

3 讨论

神经元对缺血敏感,脑梗死发生后,梗死区的神经元即发生不可逆性损伤,而缺血半暗带区的神经元则处于可逆状态。挽救这些残存脑组织,恢复神经运动功能是当务之急。而神经系统突触的结构和功能的可塑性是恢复神经运动功能的基础。神经元树突及轴突的出芽和再生是神经元在损伤及缺血时发生可塑性变化的重要标志[2]。

MAP-2和NF均为神经细胞骨架的成分,分别存在于神经细胞的树突和轴突以及胞体中,两者对于神经元的发育、分化、重塑、细胞结构的维持、神经元突起的生长等具有重要意义[3]。NF分别由低相对分子质量(NF-L)、中等相对分子质量(NF-M)和高相对分子质量(NF-H)3种亚单位组成,我们选取NF-L为观测指标。本研究结果表明,针刺督脉经穴能使局灶性脑缺血再灌注大鼠缺血半暗带区MAP-2和NF-L的mRNA表达上调,由此证实针刺督脉经穴能促进神经元树突和轴突的出芽和再生,提高神经元的可塑性,从而改善神经功能缺损状态,发挥神经保护作用。

[1] Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S,. Reversible middlecerebral artery occusion without craniectomy in rats[J]. Stroke, 1989,20(1): 84-91.

[2] Glauser T, Ben-Menachem E, Bourgeois B,. ILAE treatment guidelines: evidence-based analysis of antiepileptic drug efficacy and effectiveness as initial monotherapy for epileptic seizures and syndromes[J]. Epilepsia, 2006,47(7):1094-1120.

[3] LoPachin RM, He D, Reid ML. 2, 5-Hexanedione-induced changes in the neurofilament subunit pools of rat peripheral nerve[J]. Neuroto- xicology, 2005,26(2):229-240.

Effect of Acupuncture at Du Meridian Points on the Expressions of MAP-2 and NF-L mRNAs in the Ischemic Penumbra in Rats with Focal Cerebral Ischemia and Reperfusion

-1,-1,2.

1.,210029,; 2.,210027,

To investigate the effect of acupuncture at Du meridian points on the expressions of neuronal microtubule- associated protein 2 (MAP-2) mRNA and neurofilament protein L (NF-L) mRNA in the ischemic penumbra in rats with cerebral ischemia and reperfusion and explore the possible mechanism of its action.Acupuncture at Du meridian points was used as an Interventional measure. A rat model of focal cerebral ischemia and reperfusion was used as a subject. The expressions of MAP-2 and NF-L mRNAs in the ischemic penumbra were examined using SYBR Green real-time and quantitative PCR after cerebral ischemia and reperfusion. Regularities in the adjusting effect of acupuncture on the above indices were observed.The expressions of MAP-2 and NF-L mRNAs increased significantly in the acupuncture and control groups compared with the model group (＞0.01) and increased more in the acupuncture and control group (＜0.05).Acupuncture at Du meridian points can upregulate the expressions of MAP-2 and NF-L mRNAs, promote the germination and regeneration of neuronal dendrites and axons and improve neuronal plasticity. That may be one of the mechanisms by which acupuncture at Du meridian points produces a protective effect on the nerve.

Acupuncture; Electroacupuncture; Cerebral ischemia and reperfusion; Rats; PCR

1005-0957(2013)03-0221-03

R2-03

A

10.3969/j.issn.1005-0957.2013.03.221

2012-10-13

王淑兰(1986 - ),女,住院医师

倪光夏(1964 - ),男,主任医师,博士生导师,E-mail:gn66@ 163.com