李晓钟王晓霞安奇君冯建宏裴毅

1.山西省人民医院急诊科，山西 太原 030032；

2.山西医科大学生物化学与分子生物学教研室，山西 太原 030001；

3.山西医学科学院，山西大医院老年肿瘤科，山西 太原 030032

RNA干扰STK15基因对人结肠癌细胞增殖和凋亡的影响

李晓钟1王晓霞2安奇君1冯建宏1裴毅3

1.山西省人民医院急诊科，山西 太原 030032；

2.山西医科大学生物化学与分子生物学教研室，山西 太原 030001；

3.山西医学科学院，山西大医院老年肿瘤科，山西 太原 030032

STK15；RNA干扰；结肠癌；凋亡

STK15(serine/threonine kinase15)是一类广泛存在于真核细胞中的丝氨酸/苏氨酸激酶，通过磷酸化下游特定底物影响G2/M期转换，促进中心体成熟、双极纺锤体建立以及染色体的分离［1-2］。许多研究表明，多种肿瘤中STK15呈高表达状态,在肿瘤的发生发展过程中发挥着重要作用［3-8］。而作为阻断基因表达的RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术为肿瘤基因治疗提供了新的策略和途径［9］。因此，本研究通过将表达靶向STK15的短发夹状双链RNA(shRNA)表达质粒，稳定转染人结肠癌细胞系SW480，观察其对STK15表达的抑制作用，并进一步研究STK15基因沉默与肿瘤细胞增殖和凋亡的关系，从而揭示利用RNA干扰技术沉默STK15基因的表达，将为结肠癌的临床治疗提供新的途径。

1 材料和方法

1.1 材料

pGPU6/GFP/Neo-STK15质粒由本室构建，人结肠癌SW480细胞由本室保存，RPMI-1640培养基、胎牛血清购自Hyclone公司，脂质体转染试剂LipofectamineTM2000 购自Invitrogen公司，逆转录及PCR试剂盒购自TAKARA公司，STK15抗体购自Cell Signal公司，β-actin和Caspase-3抗体购自Santa Cruz公司，增强型化学发光(enhanced chemiluminescence，ECL)试剂购自北京普利莱基因技术有限公司，碘化丙啶(PI) 染色液、RNase A购自碧云天生物技术有限公司，四甲基偶氮唑蓝［3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2Htetrazolium bromide，MTT］购自北京赛驰生物科技有限公司，二甲基亚砜(DMSO)购自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

结肠癌细胞系SW480细胞，常规培养于含10%胎牛血清、100 U/mL的青霉素、100 mg/L链霉素的RPMI-1640培养液中，置于37 ℃、CO2体积分数为5%培养箱中培养。

1.2.2 稳定转染

细胞达70%融合时，用无血清培养基洗3遍，将20 µL LipofectamineTM2000和10 µg pGPU6/GFP/Neo-STK15质粒或空载体pGPU6/GFP/Neo分别稀释于500 µL无血清培养基中，室温温育5 min。再将稀释的脂质体与质粒DNA混合，室温温育20 min后将其加入细胞培养皿内，补充无血清培养基至2 mL。6 h后补加含20%胎牛血清的培养基2 mL，24 h后换含10%胎牛血清的培养基。48 h后加入G418筛选，14 d后获得STK15基因沉默的稳定克隆，并扩大培养。

1.2.3 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测

参照TRIzol说明书提取细胞总RNA。细胞中加入1 mL TRIzol，移至EP 管中，再加入0.2 mL氯仿，室温下放置2～3 min后，12 000×g离心15 min，取上层水相置于新EP管中，加入0.5 mL异丙醇，室温下放置10 min，12 000×g离心10 min。弃上清液，加1 mL 75%乙醇进行洗涤沉淀，10 000×g离心5 min，弃上清液。沉淀RNA自然干燥后用DEPC水溶解。以RNA为模板，Random 6 mers和Oligo dT 为引物，在逆转录缓冲液中经逆转录酶催化生成cDNA。再以cDNA 为模板，dNTP为原料，在PCR缓冲液中经Taq酶催化扩增STK15 基因，上游引物为：5’-AATGATTGAAGGTCGGATGC-3’；下游引物为：5’-TTCTCTGAGCATTGGCCTCT-3’。以看家基因GAPDH 为内参照，其引物为：上游： 5’-GCT GAG AACGGGAAGCTTGT-3’；下游：5’-GCCAGGGG TGCTAAGCAG TT-3’。引物由TAKARA公司合成。反应条件为：94 ℃ 30 s变性，58 ℃ 30 s退火，72℃ 30 s延伸，共30 个循环。PCR 扩增结束后，经琼脂糖凝胶电泳鉴定结果。图像分析系统测定灰度值。

1.2.4 蛋白质印迹法(Western blot)检测

细胞中加入蛋白裂解液(50 mmol/L Tris (pH为7.4)，150 mmol/L NaCl，1% NP-40，0.1% SDS，1 µg/mL Aprotinin，1 µg/mL leupeptin，100 µg/mL PMSF)，冰上作用40 min，12 000×g，离心20 min，取上清液即为细胞总蛋白。蛋白加热变性后，经10% SDS-PAGE电泳分离，然后电转移至硝酸纤维素膜上。用含5%脱脂奶粉的PBS溶液封闭2 h，加入兔抗人多克隆一抗STK15(1∶1 000)或Caspase-3(1∶1 000)，4 ℃温育过夜。洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的兔抗羊二抗(1∶2 000)，室温下温育1 h。ECL法检测目的条带。β-actin作为内参。图像分析系统测定灰度值。

1.2.5 MTT法检测细胞的增殖情况

将对数生长期细胞消化后制成单细胞悬液，以每孔3 000个接种于96孔培养板上，置于37 ℃、CO2体积分数为5%培养箱培养，每组6 孔，分别在第1、3、5、7、9天以MTT法检测其吸光度(A)值。每孔中加入浓度为0.2 mg/mL的MTT液100 μL继续培养3 h，吸去上清液，加入DMSO 150 μL/孔，充分震荡10 min后，用酶标仪在570 nm 波长比色测定每孔A值，绘制生长曲线。

1.2.6 流式细胞技术检测细胞凋亡率

收集细胞，PBS洗3次，冷乙醇4℃固定过夜。上机前500×g离心收集细胞，加入RNase A(1 mg/mL)，37 ℃水浴30 min，再加入PI染色液(50 μg/mL) ，至4 ℃避光30 min，用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率。

1.2.7 统计学处理

2 结 果

2.1 RT-PCR检测STK15 mRNA表达的抑制情况

pGPU6/GFP/Neo-STK15质粒及空载体pGPU6/GFP/ Neo转染细胞，经G418筛选稳定克隆后，采用RT-PCR检测STK15 mRNA水平的表达。与对照组相比，筛选到的两个STK15基因沉默稳定细胞系(将其分别命名为pGPU6-STK15-1和pGPU6-STK15-2)中，STK15 mRNA表达水平明显降低。灰度分析显示，与对照组相比，pGPU6-STK15-1和pGPU6-STK15-2细胞中STK15 mRNA水平分别下调90%和88%。表明稳定转染pGPU6/GFP/Neo-STK15质粒的细胞中STK15 mRNA的表达明显受到抑制(图1)。

图 1 RNAi对STK15 mRNA表达的影响Fig. 1 Effect of RNAi-STK15 on STK15 mRNA expression

2.2 Western blot检测STK15蛋白表达的抑制情况

与对照组相比， pGPU6-STK15-1和pGPU6-STK15-2细胞系中，STK15 蛋白表达水平明显降低。灰度分析显示，与对照组相比，pGPU6-STK15-1和pGPU6-STK15-2细胞中STK15蛋白水平分别下调89%和85%。表明稳定转染pGPU6/GFP/Neo-STK15质粒的细胞中STK15蛋白的表达也受到明显抑制(图2)。

图 2 RNAi对STK15蛋白表达的影响Fig. 2 Effect of RNAi-STK15 on STK15 protein expression

2.3 RNAi-STK15对SW480细胞增殖的影响

与对照组相比， pGPU6-STK15-1和pGPU6-STK15-2细胞系的增殖能力明显降低，差异有统计学意义(P＜0.01)。表明STK15基因沉默能抑制肿瘤细胞的增殖(图3)。

图 3 RNAi-STK15对SW480细胞增殖的影响Fig. 3 Effect of RNAi-STK15 on SW480 cell proliferation

2.4 RNAi-STK15对SW480细胞凋亡的影响

流式细胞技术分析显示，对照组细胞的凋亡率为3.8%，pGPU6-STK15-1和pGPU6- STK15-2细胞系的凋亡率分别为12.9%和11.8%(图4A)，重复实验3次后经统计学分析，差异有统计学意义(P＜0.01)。Western blot分析显示，与对照组相比，pGPU6-STK15-1和pGPU6-STK15-2细胞系中，Caspase-3酶原蛋白表达量明显降低，而Caspase-3剪切带表达明显增加(图4B)。表明STK15基因沉默能促进肿瘤细胞的凋亡。

图 4 RNAi-STK15对SW480细胞凋亡的影响Fig. 4 Effect of RNAi-STK15 on SW480 cell apoptosis

3 讨 论

结直肠癌是较为常见的消化道恶性肿瘤之一，其发病率有逐渐上升的趋势。目前治疗方法仍以传统的放化疗和手术治疗为主，但预后较差。因此，寻求有效的结直肠癌治疗方法至关重要。

人类STK15基因，又称BTAK、ARK1、AIK1、STK6、Aurora-A、A urora-2，编码一含403个氨基酸的蛋白质，相对分子质量为46×103，属于丝/苏氨酸激酶家族成员［1-2］。许多研究表明STK15是一种潜在的癌基因，在多种肿瘤中呈高表达状态，并在肿瘤的发生、发展过程中起到了重要的作用［3-8］。Bischoff等［8］研究表明，STK15在结肠癌中也存在高表达。因此，抑制STK15基因的表达将可能为结肠癌的治疗提供新的思路。RNA干扰技术是利用双链RNA特异性地降解具有同源序列的mRNA，从而阻断相应基因的表达［9］。由于其介导了精确的基因沉默，因此，通过RNA干扰抑制癌基因的表达成为了一种新的治疗策略。研究报道，RNA干扰介导的沉默STK15基因的表达能抑制食管癌［10］和乳腺癌［11］等肿瘤细胞的增殖，促进肿瘤细胞凋亡。而关于STK15基因干扰后对结肠癌细胞SW480增殖和凋亡的影响鲜见文献报道。

本研究表明，通过将STK15基因的shRNA真核表达质粒pGPU6/GFP/Neo-STK15转染人结肠癌细胞系SW480，RT-PCR及Western blot均证实RNAi有效沉默了STK15基因的mRNA及蛋白表达。而且MTT实验证实，STK15基因沉默能抑制肿瘤细胞的增殖。同时流式细胞技术分析证实，STK15基因沉默能促进肿瘤细胞的凋亡。我们进一步通过检测Caspase-3的表达分析了STK15基因沉默对凋亡的影响。Caspase-3是一类天冬氨酸残基特异性的半胱氨酸蛋白酶，在细胞凋亡过程中起关键作用。Caspase-3 在Caspase 家族介导的蛋白酶级联反应中处于最后效应阶段，活化后的Caspase-3 促进凋亡小体形成，是细胞凋亡最终的执行者［12］。相对分子质量为32×103的Caspase-3酶原在活化过程中从Asp28～Ser29和Asp175～Ser176两处被剪切，从而裂解形成P17和P10两个片段［13］。因此，通过检测Caspase-3表达的变化可以反映细胞的凋亡情况。本研究表明，与对照组相比，STK15基因沉默组中Caspase-3酶原蛋白表达明显降低，而Caspase-3剪切带明显增加，提示Caspase-3活化，从而进一步证明STK15基因沉默能促进肿瘤细胞凋亡。

综上所述，通过将靶向STK15的shRNA真核表达载体导入细胞可以高效特异地沉默人结肠癌细胞中STK15的表达。而STK15的表达沉默可以抑制肿瘤细胞的增殖，促进肿瘤细胞凋亡。因此，本研究不仅提示了STK15有望成为结直肠癌基因治疗中的新靶点，而且通过应用RNA干扰的方法抑制STK15基因的表达将可能成为基因治疗的新途径。

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10.3969/j.issn.1007-3969.2013.06.013

R735.3+5

：A

：1007-3639(2013)06-0467-04

2012-12-27

2013-03-18）

国家自然科学基金(No：30973401)；山西省自然科学基金(No：2009011052)。

王晓霞 E-mail:wxiaoxia99007@yahoo.com.cn