马延娜， 薛 静， 徐摇光， 张晓东*

1.首都师范大学生命科学院，北京100037；

2.北京市农林科学院北京农业生物技术研究中心，北京100097

植物化学诱导基因表达系统研究进展

马延娜1，2， 薛 静2， 徐摇光2， 张晓东2*

1.首都师范大学生命科学院，北京100037；

2.北京市农林科学院北京农业生物技术研究中心，北京100097

随着植物基因工程的发展，植物的化学诱导表达系统受到越来越多的重视。化学诱导表达系统通常包含两个元件，第一个元件多为一个嵌合的转录因子，可以特异性的结合到启动子上；第二个元件具有前面的转录因子的结合位点，从而控制目的基因的表达。本文综述了当前广泛应用的一元诱导基因表达系统，如四环素诱导表达系统，和二元诱导表达系统，包括：乙醇诱导、地塞米松诱导、β2雌激素诱导和热休克诱导等不同系统，总结了各化学诱导表达系统的最新研究进展及其潜在利用的可行性。

化学诱导；激活子；效应因子；一元基因盒；二元基因盒

目前大规模商业化的转基因产品中广泛应用的启动子多是组成型启动子，例如双子叶植物中常用的来自花椰菜花叶病毒（CaMV）的35S启动子和来自农杆菌的胭脂碱合酶（Nos）启动子，单子叶植物中经常应用的水稻肌动蛋白-1（Rac1）启动子以及玉米泛素-1（Ubi-1）启动子等［1～3］。

随着植物基因工程的发展，用特异性启动子取代组成型启动子，对外源基因的表达进行精确调控，使其在植物体内适时、适量地表达，显得尤为重要。组织特异性启动子调控基因只在某些特定组织或器官中转录，对于阐明植物生长发育、代谢途径等非常重要，具有很好的应用前景。与组织特异性启动子相比，诱导型启动子有着独特的优点，可根据需要，在植物的特定发育阶段、特异的组织器官或特定生长环境下，施加诱导信号，诱导目的基因的表达；也可解除胁迫，让目的基因的表达停止。这种快速、定点诱导外源基因转录的“开”与“关”，可真正实现外源基因的精确调控。在各类诱导型启动子中，化学诱导系统由于可控性强，应用最为广泛。

化学诱导表达系统通常包含两个元件，第一个元件多为一个嵌合的转录因子，可以特异性的结合到某些基因的启动子上。这个嵌合的转录因子只有在受到诱导后才能激活下游启动子的转录，通常称之为激活子；第二个元件具有前面的转录因子的结合位点，通常称这个元件为效应因子。效应因子的两端通常会有一个组成型表达的mini35S启动子，从而能够保证一个最基本的转录机制，但是要通过内源的转录激活子将它的激活活性降到最低。激活子和效应因子可以同时在一个基因盒中，为一元的基因盒表达系统；也可以分别位于不同的载体上，为多元基因盒表达系统，应用较多的多为二元基因盒诱导表达系统［4］。

通过化学诱导表达系统可以实现对目标基因转录的去阻遏、失活和激活。对目标基因转录的去阻遏系统研究和应用较多的主要是基于四环素受体的去阻遏诱导系统，基于四环素受体还构建有失活基因表达系统。基于目标基因转录激活的诱导表达系统在植物中研究最多，也应用最为广泛，包括：基于糖皮质激素受体的可诱导基因表达系统、基于糖皮质激素受体和四环素抑制因子的双向诱导基因表达系统、基于雌激素受体的甾类激素诱导的表达系统和基于蜕皮激素受体的杀虫剂诱导表达系统等。这些诱导表达系统的原理及应用在前人的研究中已得到详细的介绍［5～7］。本文主要讨论植物化学诱导表达系统的最新研究进展及其潜在利用的可行性。

1 一元诱导表达系统

目前四环素被广泛用于人工构建的基因诱导表达系统。该系统通过四环素结合到四环素受体上来调控目标基因的转录。由于四环素的诱导效率依赖于四环素受体的浓度，且高浓度的四环素对所诱导的植物是有害的，而植物中四环素受体浓度有限，使得四环素诱导表达系统的应用也受到极大的限制，因此发展新的四环素衍生物对于提高基于四环素受体的诱导表达系统的应用范围具有重大意义。目前，对四环素衍生物的研究越来越受到重视，并已经开发出上千种四环素衍生物，但是其中只有少数可以被利用［8］。Aleksan

drov等［9］利用荧光实验和自由能分子动力学模拟实验分别对四环素及15种四环素衍生物与四环素受体的结合特异性进行了研究，研究发现在某些位点具有疏水基团的四环素衍生物能够促进其结合到四环素受体上。4-二甲氨基类的四环素衍生物相比于含疏水基团的四环素衍生物具有更强的促进作用，能够极大地提高同四环素受体的结合效率，从而在较低浓度条件下就能达到较好的诱导效果。

别构效应在化学诱导表达系统中发挥着关键的作用，如在基于四环素受体的诱导系统中，在无诱导剂时四环素受体为一种构象，在诱导剂出现后通过变构效应，转变成为可与DNA结合的构象［10］。在四环素的替代物的研究方面，除了构建新的四环素衍生物之外，Goeke等［11］发现一些短链的活性肽也可以作为四环素受体的诱导剂、反诱导剂或者辅阻遏物。这些活性肽可以持续地结合在四环素受体的四环素结合位点，显著地引发四环素受体的别构行为继而引起诱导、失活或者阻遏效应。更进一步的研究发现诱导基因表达和诱导基因失活的活性肽是分别结合在四环素受体的不同位置，分别进行各自的调控反应。诱导表达系统的工作原理主要是基于蛋白质与蛋白质之间的相互作用，因此这些活性肽的发现无疑对蛋白质介导的基因表达调控系统产生重大的影响，对于我们更加深入的研究和应用化学诱导表达系统具有深远的意义。

2 二元诱导表达系统

大多数诱导表达系统为单一的盒式系统，虽然这些系统已经在一定程度上加快了转化过程，但是二元诱导表达系统为载体整合到植物基因组中后进一步验证系统的功能提供了可能。二元诱导系统可以通过优化选择不同功能激活子和效应因子的组合而避免不希望出现的副作用。这些组合通过相互交换组合，从而获得一个完全的诱导表达系统。此外，二元诱导表达系统能够通过不同的激活子和效应因子组合来确保多种功能的实现，通过不同的组合易于筛选出只限于特定组织或者可以耐受多重效应因子的诱导表达组合。

2.1 乙醇诱导的基于AlcR／AlcA的基因表达系统

AlcR转录因子（激活子）和AlcA启动子（启动目的基因表达）是从Aspergillus nidulans中分离出来的［12～14］。在这个系统中AlcR转录因子受乙醛诱导激活，乙醛是植物中的乙醇代谢途径中产生的。在拟南芥中AlcA启动子不能被内源的转录因子激活，即使是在厌氧条件下也不能够激活［13］。在这个系统中，激活子和启动子分别位于两个不同的植物转化载体上。这个系统非常适合利用脉冲进行诱导或者进行局部诱导，因为利用特异的启动子和乙醇快速蒸发的性质可以对AlcR的表达进行精确的调控，使其以精确的模式发挥作用［15，16］。但是由于乙醇对植物的毒性作用，脉冲诱导必须进行仔细校准以确保在最短的时间内达到最大的诱导效应。

2.2 地塞米松诱导的基于融合糖皮质激素受体、GVG／UAS或者pOp／LhGR诱导表达系统

这三种诱导表达系统都是基于糖皮质激素受体（GR）的配体结合域的反应特性而构建的［17］。该结构域含有93个氨基酸，在没有甾类激素存在时，GR同细胞质基质中的热休克蛋白HSP90相互作用，而转录因子与GR的结合是没有激活活性的，由于它们同HSP90结合锚定在细胞质中，因此不能进入到细胞核中［18］。但是在经过人工合成的甾类激素地塞米松的处理后，GR-HSP90之间的相互作用就被中断，释放出HSP90，从而使GR-转录因子复合体可以进入细胞核。在细胞核中，转录因子结合并激活目的基因的表达。该系统的优越性在于糖皮质激素受体结构域可以直接与目标转录因子结合［19，20］。

如果目标基因不是转录因子，还可以利用含有GR结构域的融合转录因子进行诱导，GVG／UAS就属于这类诱导表达系统。GVG激活子含有一个酵母菌Gal4 DNA结合结构域、来自疱疹病毒的强转录激活子VP16和GR受体［21］。目的基因的复制受到位于上游的一个激活序列（UAS）的调控。该系统现已成功应用，但是诱导产物需要小心谨慎地进行处理，在拟南芥和若干其他植物的应用研究中发现，高表达水平的GVG会导致严重的生长发育缺陷甚至死亡［22～28］。

另一种基于糖皮质激素受体的二元诱导表达系统pOp／LhGR的激活子LhGR包括一个同大肠杆菌lac受体具有较高亲缘性的突变体，这个突变体同酵母菌的Gal4转录激活结构域融合，并同GR结合［29］。目的基因可以通过下6个拷贝数的lac操作子进行复制。这个系统相较于前两个系统有着独特的优势，它既可以利用一元基因盒模式也可以通过二元模式高效、快速地进行诱导表达，到目前为止的报道中均未发现副作用，该系统通过优化已成功应用于烟草中［30～33］。

2.3 β2雌激素诱导的XVE／OlexA基因表达系统

XVE激活子含有一个lexA受体结构域，这个结构域同VP16转录激活结构域和人雌激素受体ER融合［34］。当向系统提供雌激素如17β-雌二醇时，XVE激活子结合到8个拷贝数的lexA结构域上，进而激活下游目的基因的转录。研究发现，在拟南芥中植物雌激素不能激活该系统，但是相关报道指出在大豆的种子中高浓度的植物雌激素可以使这个系统非特异性的激活［35］。但是对于外源的雌激素如β-雌二醇，在高达25μmol／L的浓度条件下既不会对拟南芥的生长发育过程产生影响，也不会对内源基因的表达产生影响［36］。因此这就大大扩展了这个诱导表达系统的使用范围。

2.4 热休克诱导表达系统

来自于拟南芥的热休克蛋白18.2（HSP18.2）基因［37］的启动子在某些植物中已经被成功用于在热休克之后诱导相关基因的表达［38～40］。在没有热休克处理时，HSP18.2的启动子是处于抑制状态的［41］。转基因植株在经过37℃的热休克处理后，通过反向激活启动下游目的基因的转录复制。

3 总结与展望

近年来关于化学诱导表达系统的应用研究非常广泛，根据各类诱导表达系统的作用机理将其简单分为一元诱导表达系统和二元诱导表达系统两大类。每种类型的诱导表达系统都各有其优点和不足，必须根据所要诱导的目的基因及研究植物种类的不同选择合适的诱导表达系统，并通过优化各种反应条件，从而达到预期的实验效果。

化学可诱导表达系统可以实现精确控制外源基因的表达，因此在基因工程应用之中具有优势，国内外研究者也对此进行了不断的研究，针对已有的成熟的诱导系统进行改造，或开发新的诱导表达系统。无论是一元诱导表达系统还是二元诱导表达系统，都可以通过进一步改造配体结构域，使用不同的激活剂、优化DNA结合结构域，优化使用最小的启动子及启动子应答元件序列等手段，最终达到降低背景表达量，提高诱导表达效率的目的。

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The Development of Chem ical Induced Gene Expression System in Plants

Ma Yan-na1，2，XUE Jing2，Xu Yao-guang2，ZHANG Xiao-dong2*
1.Collage of Life Science，Capital Normal University，Beijing 100037，China；
2.Beijing Agricultural Biotechnology Research Center，Beijing Academy of Agriculture and Forestry Science，Beijing 100097，China

With the development of plantgenetic engineering，the application of plant chemical induced gene expression system is becomingmore and more important.Chemical induced gene expression system typically consists of two components，the first component is mostly a chimeric transcription factor which can specific bind to the promoter.The second element has a transcription factor binding site for the first element，and thereby controlling the expression of target genes.Here，we review the currentwidely used one component inducible gene expression system，such as the tetracycline inducible expression system，and two components inducible expression systems，including：ethanol-induced，dexamethasone-induced，β2 estrogen hormoneinduced and heat shock-induced systems.This papermainly discusses the recent progress on chemical inducing gene expression systems and their potential use in plants.

chemical induction；activator；effector；single gene cassette；binary gene cassette

10.3969／j.issn.2095-2341.2013.01.09

2012-11-01；接受日期：2012-12-25

马延娜，硕士研究生，研究方向为分子遗传学。*通讯作者：张晓东，研究员，博士，主要从事作物遗传育种研究。E-mail：zhangxiaodong＠baafs.net.cn