刘文文， 李文学

中国农业科学院作物科学研究所，北京100081

植物bHLH转录因子研究进展

刘文文， 李文学*

中国农业科学院作物科学研究所，北京100081

bHLH（basic helix-loop-helix protein）是真核生物中存在最广泛的一大类转录因子，其通过特定的氨基酸残基与靶基因相互作用，进而调节相关基因的表达。系统发育分析表明植物的bHLH转录因子为单源进化。bHLH转录因子不仅对于植物的正常生长和发育必不可缺，同时参与植物适应多种逆境胁迫的反应过程。然而，由于植物bHLH家族成员众多、参与的生物过程复杂，对于其了解还不是十分清楚。本文针对植物bHLH的进化、结构特点、生物功能，尤其是在适应逆境胁迫中作用等的最新研究结果进行综述，以期为进一步深入了解植物bHLH转录因子的功能提供理论参考。

bHLH；结构特点；生物学功能

bHLH转录因子广泛存在于真核生物。自bHLH发现以来，越来越多的研究表明该转录因子对于真核生物的正常生长及发育必不可缺。在酵母等单细胞真核生物中，bHLH参与染色体的分离、新陈代谢调节等过程［1］；在动物中，bHLH主要与感知外界环境、调节细胞周期、组织分化等相关［2～4］。植物中bHLH家族成员数量众多，仅次于MYB类转录因子，譬如在拟南芥中有超过140个bHLH转录因子，水稻中则超过160个。家族的庞大不可避免的造成功能冗余，使研究单个bHLH转录因子的功能相对困难。本文拟对有限的植物bHLH家族研究结果，尤其是参与植物适应逆境胁迫过程中的作用进行综述，以期为进一步深入了解植物bHLH转录因子的功能的提供理论参考。

1 植物bHLH的结构特点、家族分类及进化

1.1 bHLH的基本结构

bHLH转录因子因含有bHLH结构域而得名。bHLH结构域由50～60个氨基酸组成，可分为长度为10～15个氨基酸的碱性氨基酸区和40个氨基酸左右的α-螺旋-环-α-螺旋区（HLH区）。碱性氨基酸区位于bHLH结构域的N-端，具有DNA识别和结合位点。植物中50%以上的碱性氨基酸区含有高度保守的H5-E9-R13序列（His5-Glu9-Arg13），其对bHLH和靶标DNA的结合必不可缺［2，5］。基因启动子区上游通常存在E-box结构，是一种有6个碱基（CANNTG）排列的特殊回文序列，能够被转录因子等蛋白质识别并结合，进而激发基因进行转录。大多数bHLH转录因子都能够识别E-box，而在线虫体内，bHLH转录因子还可以与非典型E-box短核苷酸（例如CACGCG和CATGCG）序列结合［6］。HLH区中有两个相连的螺旋结构，多由疏水氨基酸组成，其中23位与64位的亮氨酸（Leu23／64）、54位的亮氨酸或异亮氨基酸（Leu／Iso54）、61位的缬氨酸（Val61）在植物bHLH中高度保守，HLH区中Leu23、Leu52残基对于二聚体的形成是必须的［7，8］。

通常，除了bHLH结构域之外，bHLH还具有保守性相对较低的结构域，存在于进化关系上相近或功能类似的家族中。譬如，动物bHLH转录因子中存在由6个亮氨酸组成的亮氨酸拉链基序（ZIP），该序列与HLH区中的第二个螺旋相邻，可通过与第二个螺旋的相互作用影响bHLH转录因子的空间结构，进而阻止bHLH转录因子形成二聚体［9］。

1.2 bHLH家族分类、进化关系及结构特点

依据进化关系、与DNA的结合模式，动物中bHLH转录因子被分为A～F六个家族［10］。根据动物的分类标准，考虑到在特定位置氨基酸的保守性及其有无除bHLH功能域之外的其他保守功能域等条件，Heim等［11］将在拟南芥中发现的133个基因划分为12个家族；随后又有14个新的bHLH转录因子被发现，并被进一步被分为21个家族［2］；但是这种分类方法仅局限于高等陆生植物。随着该家族成员在苔藓、海藻等物种中被更多的发现与鉴定，bHLH转录因子被细分为32个家族［7］。

动物A家族成员大都可以与CAGCTG或CACCTG类型的E-box结合，并且此类蛋白质的第8位多为精氨酸；B类的第5位则多为赖氨酸或组氨酸，第23位多为精氨酸，能够与CACGTG或CATGTTG类型的E-box结合。植物中53% bHLH转录因子的结构特点与动物的B类相符，符合H5-E9-R13结构特点；8%与动物A类结构特点相符，含有R8-E9结构［12］，表明大部分植物bHLH同样能与E-box结合。在167个水稻bHLH转录因子中，有141个成员具有与DNA结合的能力，其中95个是与G-box（E-box的一种）结合的，19个与其他种类E-box结合，27个与非E-box DNA结合；拟南芥的147个bHLH转录因子中有89个与G-box结合，20个与其他种类E-box结合［13］。动物E类bHLH除了具有H5-E9-R13的结构特点外，第6位为保守的脯氨酸，主要与N-box（CACGCG或CACGAG）结合；C类、F类bHLH中具有的PAS和COE保守域，这几类bHLH在植物中尚未发现；同时植物中有11%的bHLH转录因子含有Q5-A9-R13，为植物所特有。

Nuno等［12］证实大多数植物bHLH转录因子家族在4亿4300万年前的陆生植物中已经存在。尽管有一定数量的基因在不同植物家系中发生了复制或丢失，但是这些家族成员在植物进化过程中仍高度保守。大约80%植物bHLH转录因子在bHLH功能域上具有内含子，尽管这些内含子的数量不同，但是位置十分保守［13，14］。通过内含子模式分析，推测植物bHLH转录因子多为单源进化，与其他真核生物bHLH之间不存在明确的进化关系。

1.3 植物bHLH二聚体

植物bHLH转录因子主要通过同源或者异源二聚体的形式发挥作用，但其中的机制尚不清楚。现在普遍认为HLH功能域的疏水氨基酸残基界面特性、带电荷氨基酸残基间的相互作用及其分子伴侣蛋白的有效性决定了bHLH转录因子同源或者异源二聚体的特性［15］。有证据表明PIF3和HFR1相互作用形成异源二聚体，不仅能够阻止PIF3与E-box的结合，而且能与光敏色素形成具有功能的三元复合体［8］。植物中研究最为清楚的当属bHLH转录因子与MYB转录因子之间的相互作用。植物中bHLH转录因子具有［DE］Lx2［RK］x3Lx6Lx3R结构，这个结构决定了bHLH转录因子之间、bHLH与MYB转录因子相互作用的特异性和稳定性［16］。此结构在被子植物和裸子植物中相对保守，表明MYB-bHLH的相互作用在进化上形成时间较早［17］。植物中bHLH能与其他蛋白形成二聚体的特性拓展了bHLH作为转录因子进行调节的范围。

2 植物bHLH转录因子的功能

2.1 bHLH参与植物生长发育

植物bHLH转录因子既可以作为转录激活子又能作为转录抑制子发挥生物学作用，并且作用方式多种多样。Heisler等［18］通过基因功能缺失突变株的结果证实SPATULA基因可促进花形态的建成，进一步的研究表明SPATULA也可作为一种光稳定型转录抑制子抑制种子的萌发，尤其在低温等逆境胁迫条件下表现的更为明显［19］。ICE1作为一个典型的组成型bHLH转录因子，通过与MUTE、FAMA和SPCH等的相互作用控制气孔细胞分化及保卫细胞的形成［20］，尽管单子叶和双子叶植物在气孔的发生、形态等方面存在差异，但是在玉米和水稻中均存在ICE1的同源基因［21］，暗示bHLH转录因子在调控气孔发育过程中的普在性。与SPATULA、ICE1的组成型表达不同，植物中大多数的bHLH转录因子具有组织与时空特异性，譬如ZmR和ZmB1分别在玉米籽粒的糊粉层和绿色组织中特异表达，表明bHLH转录因子主要在特定的发育阶段起作用。

2.2 bHLH参与植物适应缺铁胁迫反应

尽管bHLH调控植物体内诸多的生化进程，但是有关bHLH转录因子参与植物非生物胁迫反应的报道还较少，已有的研究主要集中在适应缺铁、温度、高盐、干旱等逆境过程。番茄中的FER基因是植物中第一个被克隆的调控植物适应缺铁胁迫的转录因子，其属于bHLH家族，主要在根的表皮细胞、薄壁细胞中表达［22］。fer突变体在低铁环境下，检测不到铁还原酶基因LeFRO1的表达，而且二价铁吸收基因LeIRT1的表达也显著降低，出现严重黄化现象［22］。通过同源克隆的方法在拟南芥中获得了AtFIT1。AtFIT1与LeFER在氨基酸水平上有72%的相似性，尤其是在bHLH区，二者的序列基本一致。与fer突变体相同，fit突变体同样不能启动植物缺铁反应机制，体内铁含量显著下降，表现出严重黄化现象［23］。BHLH38、BHLH39、BHLH100以及BHLH101也参与植物适应缺铁胁迫反应过程［24，25］。BHLH38和BHLH39可以与FIT1形成异源二聚体，将BHLH38或者BHLH39与FIT1在拟南芥中同时过量表达，转基因植株中FRO2和IRT1持续高表达，与缺铁与否无关，与野生型相比，转基因植株可以积累更多的铁［25］，表明FIT1与BHLH38或者BHLH39共同作用调控植物适应缺铁胁迫反应。

2.3 bHLH参与植物适应其他非生物胁迫逆境反应

ICE1除在植物气孔形态建成中起到重要作用外，还能特异性结合CBF启动子碱基序列调节CBF的表达，CBF转录因子进而通过调节下游与耐受冷胁迫相关基因表达来提高植物的抗低温胁迫的能力［26］；PIF4作为一种bHLH家族植物色素相互作用蛋白因子，不仅参与植物提光敏信号的传递过程，同时通过与FT基因的互作控制温度感应的开花行为［27］，通过与BZR1基因的相互作用参与环境、油菜素内酯互作调控植物的生长发育进程［28］；bHLH92的表达受盐、干旱、渗透、冷等多种胁迫的强烈诱导，基因敲除突变株对渗透胁迫超敏感，高盐处理条件下电解质渗透物显著增加，而过量表达bHLH92的转基因植株则表现出较强的抗盐胁迫的能力［29］。Kim等［30］研究指出，AtNIG1是拟南芥中钙离子结合bHLH转录因子，能与很多盐响应相关基因的上游启动子结合，从而提高转基因植株的抗盐能力，该转录因子在盐信号转导过程中起重要作用。从陆地棉中分离得到的GhbHLH1转录因子，则可被ABA、干旱、盐胁迫所诱导表达［31］。Li等［32］从水稻中分离的OrbHLH001，是一种类ICE1的bHLH转录因子，过表达该基因的拟南芥抗盐及抗冻能力均得到提高，但OrbHLH001的功能与ICE1并不相同，而是不依赖于CBF／DREB1的独立路径。现在普遍的观点认为，bHLH转录因子处于植物适应逆境胁迫调控网络中较为下游的位置，直接调节逆境胁迫响应基因，调节方式更为具体和精细。

3 植物bHLH研究中存在的问题及展望

近年的研究虽然在认识植物bHLH转录因子结构、家族分类、起源与功能方面取得了很大的进展，但由于植物bHLH转录因子家族成员众多、功能多样、作用方式复杂，要全面认识植物bHLH转录因子家族还有很多工作要做：

①植物bHLH转录因子家族的分类研究。已有的结果表明bHLH转录因子为单源进化，现有的分类主要参考动物中的分列标准。目前有关植物bHLH转录因子的功能还不十分透彻，不能根据具体功能对植物bHLH家族进行分类，这需要加强对植物单个bHLH转录因子的功能研究。

②植物bHLH结构、作用机制的研究。植物bHLH是一类非常古老的基因，除了具有bHLH功能域外，还有很多其他功能未知的结构，对于这些功能未知结构的研究将有助于加深人们对于bHLH的了解。此外，尽管对于很多植物bHLH结合的靶DNA进行了预测和分析，并提出植物bHLH转录因子多可结合E-box，但是仅对一小部分bHLH转录因子进行了验证，大规模的作用机制验证还需开展。

由于bHLH的作用机制多种多样，对于家族中具体成员功能机制研究并不多，这就需要更多的科研工作者更加深入的研究，随着生物技术的不断革新，植物bHLH转录因子的神秘面纱也将逐渐被人类揭开。

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Progress of Plant bHLH Transcription Factor

LIUWen-wen，LIWen-xue*
Institute of Crop Science，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China

Basic helix-loop-helix proteins（bHLHs）are found throughout the eukaryotic kingdom，and constitute one of the largest families of plant transcription factors.They can regulate gene expression through interaction with specific motif in target genes.Phylogenetic analysis indicates that plant bHLHs are monophyletic.bHLHs are necessary for plant normal growth and development，and play important roles in abiotic-stress responses.However，we know little about their origins，structures，and functions due to the large quantities and complexity of plant bHLH family.This paper reviews on the evolution，structure characteristics，biological function of plant bHLHs，especially their functions in adapting to abiotic-stress tolerance，so as to provide a theoretical reference for further research on the function of plant bHLH transcription factors.

bHLHs；structural features；biological function

10.3969／j.issn.2095-2341.2013.01.02

2012-12-12；接受日期：2012-12-31

国家自然科学基因项目（30970221）资助。

刘文文，硕士研究生，研究方向为玉米氮利用效率生理学及拟南芥抗逆作用机制。*通讯作者：李文学，研究员，博士，主要从事小RNA功能及植物抗逆机制研究。E-mail：liwenxue＠caas.cn