温晓梨，孙宏卫，欧小利，王妮，梅柱中，姜勇

在细胞的炎症反应中，丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)的激活处于核心地位。有研究显示，抑制p38MAPK与JNK激酶的功能可有效减轻炎症症状[1]。双特异性磷酸酶1(dual specificity phosphatases 1，DUSP1)又称MKP1丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶1(MAPK phosphatase 1)，在细胞内主要催化已活化的MAPK家族成员(p38、JNK、ERK)特异性基序TxY中磷酸基团的水解，从而抑制其活性。MAPK激活可快速诱导DUSP1基因的表达，是MAPK信号转导通路中重要的负反馈调节机制[2-3]。近年发现，某些基因mRNA的3'端非翻译区(untranslated region，UTR)存在富含腺嘌呤核苷与尿嘧啶核苷的元件(adenosine and uridine rich element，ARE)，多种ARE结合蛋白(ARE-binding proteins，ARE-BPs)如人抗原R(HuR)、含KH结构域的剪切性调节蛋白(KHSRP)、锌指蛋白(TTP)等，均可通过与ARE的特异性结合而调控相关基因的表达水平[4-5]。另外，小分子RNA(miRNA)也可通过识别3'-UTR特异性序列而介导靶基因mRNA的降解或(和)翻译抑制。有研究显示HuR和microRNA101可与DUSP1 3'-UTR结合，从而在转录后水平调控DUSP1基因的表达[6-7]。生物信息学分析发现，在DUSP1 mRNA的3'-UTR中存在3个ARE元件以及多个潜在的miRNA结合位点，为进一步筛选可通过DUSP1 3'-UTR调控DUSP1基因表达的RNA结合蛋白(RBP)和miRNA，本研究构建了DUSP1 3'-UTR双荧光素酶报告基因表达载体，并对其功能进行了鉴定。

1 材料与方法

1.1 主要材料及试剂 真核表达载体pGL3-control、pRL-TK、pCDNA3.1、pcDNA3.1-HuR-FLAG、大肠埃希菌DH5α、NIH3T3和RAW264.7细胞(美国ATCC)，24孔板和细胞培养皿(Corning 公司，美国)，DMEM培养液和胎牛血清、总RNA提取试剂Trizol(Invitrogen公司，美国)，DNA ladder、KOD Plus DNA聚合酶(TOYOBO，日本)，限制性内切酶、T4DNA连接酶(TaKaRa公司，日本)，质粒提取试剂盒和凝胶回收试剂盒、Dual-Luciferase® Reporter Assay System检测试剂盒(Promega公司，美国)，jetPRIME转染试剂(Polyplus公司，法国)，mmu-miR101a(上海吉玛公司合成)，其他试剂均为国产分析纯。引物合成及测序由Invitrogen公司(美国)完成。

1.2 方法 从GenBank获得小鼠DUSP1 3'-UTR的编码序列并进行生物信息学分析，其中miRNA的潜在结合位点采用TargetScan 6.0(http∶//www.targetscan.org)软件进行分析。

1.2.1 小鼠DUSP1 3'-UTR的RT-PCR扩增 RAW264.7细胞用含10%胎牛血清的DMEM于37℃、5%CO2条件下在3.5cm皿中培养，达70%~80%融合时按Trizol试剂说明书提取总RNA。采用RT-PCR扩增DUSP1 3'-UTR目的片段，上游引物为3'-AGGGCAAGGGGAGGTGTGGAG-5'，下游引物为3'-GAGAATTCCAATAGAAACGTCATAATTTATTC TG-5'，下划线为EcoRⅠ酶切位点，扩增产物大小为693bp。采用KOD Plus 聚合酶进行PCR反应，反应条件为： 94℃ 30s，60℃ 30s，68℃ 1min，35个循环。1.2.2 pGL3-Luc-DUSP1-3'UTR(LuDP)重组质粒的构建 DUSP1 3'-UTR的PCR扩增产物采用EcoRⅠ进行酶切，pGL3-control载体先进行XbaⅠ酶切并用Klenow DNA聚合酶大片段补平，然后采用EcoRⅠ进行酶切，将PCR扩增产物的酶切片段和pGL3-control载体的酶切片段通过琼脂糖凝胶回收，采用文献[8]中的方法将DUSP1 3'-UTR片段克隆至pGL3-control载体中荧光素酶(luciferase)编码序列的下游，获得LuDP重组质粒，并对LuDP进行PCR扩增、限制性内切酶酶切、DNA测序鉴定。

1.2.3 LuDP/RL重组质粒的构建 将LuDP用NotⅠ和BamHⅠ，pRL-TK用BglⅡ和XbaⅠ，pLenti6-TR用NotⅠ和XbaⅠ分别进行双酶切，将LuDP中的荧光素酶表达模块与来源于pRL-TK质粒的海肾荧光素酶(renilla luciferase，RL)表达模块克隆至处理好的pLenti6-TR质粒中，得到重组质粒LuDP/RL，对重组体进行PCR扩增及限制性内切酶酶切鉴定。

1.2.4 细胞分组及荧光素酶活性检测 将NIH3T3细胞以4×104/孔铺于24孔板，用含10%胎牛血清的DMEM于37℃、5%CO2条件下培养，24h后至细胞融合度约为40%时，按jetPRIME转染试剂说明书操作，0.1μg pRL-TK分别与0.1μg LuDP和pGL3-control(作为阳性对照)共转染，0.2μg LuDP/RL分别与0.1μg HuR表达载体(pcDNA 3.1-HuR-FLAG)和pCDNA3.1(作为对照)共转染，0.2μg LuDP/RL分别与50nmol/L mmu-miR101a和Control dsRNA(作为对照)共转染，48h后收获细胞，采用Dual-Luciferase®Reporter Assay System检测试剂盒检测荧光素酶活性，具体操作按说明书进行。

图1 小鼠DUSP1 3'-UTR序列生物信息学分析结果Fig. 1 Bioinformatics analysis of mouse DUSP1 3'-UTR sequence1. Potential binding site of miR-25/32/92abc/363-3p/367; 3. Potential binding site of miR429/200b/200c; 5. Potential binding site of miR-let7/miR98; 6. Potential binding site of miR144/miR101ab; 2, 4, 7. Adenosine and uridine rich elements (AREs)

图2 LuDP重组质粒的Hind Ⅲ/EcoR Ⅰ双酶切鉴定Fig. 2 Identification of plasmid LuDP by Hind Ⅲ/EcoR Ⅰenzyme digestionM. DNA ladder; 1. LuDP digested by HindⅢ/EcoRⅠ

图3 LuDP/RL质粒模式图Fig.3 Schematic diagram of LuDP/RL

2 结 果

2.1 小鼠DUSP1 3'-UTR生物信息学分析结果 从GenBank获得小鼠DUSP1 3'-UTR全长序列并进行生物信息学分析，结果显示其中含有3个ARE元件和4个潜在的miRNA结合位点(图1)。

2.2 LuDP与LuDP/RL重组质粒鉴定结果 LuDP质粒全长5954bp，经HindⅢ和EcoRⅠ双酶切后可得到约2.2kb和3.7kb的片段，大小符合预期(图2)。LuDP/RL质粒大小为10 706bp，经XbaⅠ单酶切后可得到约6.8kb、2860bp和320bp的片段，大小符合预期，经HindⅢ单酶切后可得到3660、3354、2365、560、470、312bp的片段，大小符合预期。LuDP/RL质粒模式图如图3所示，测序结果进一步证实重组质粒构建成功。

2.3 荧光素酶报告基因活性检测结果 将质粒LuDP与内参照质粒pRL-TK共转染NIH3T3细胞，48h后回收细胞进行检测，结果显示其荧光素酶活性是阳性对照(pGL3-control与pRL-TK共转染NIH3T3细胞)的0.14±0.01倍，差异有统计学意义(P＜0.01)，表明DUSP1 3'-UTR对基因的表达起负调控作用。将LuDP/RL分别与RNA结合蛋白HuR表达载体、mmu-miR-101a共转染NIH3T3细胞，48h后回收细胞进行检测，结果显示共转染HuR表达载体后，其荧光素酶活性是对照组的1.40±0.20倍，而共转染mmu-miR-101a后，荧光素酶活性是对照组的0.57±0.18倍，差异均有统计学意义(P＜0.05)。

3 讨 论

基因在细胞中的转录后调控通常是由位于成熟mRNA的5'或3'端非翻译区(UTR)的特异性调控元件与特定的RNA结合蛋白和(或)非编码RNA相互作用，介导成熟mRNA的出核转运、胞质定位、蛋白翻译，从而调控基因在细胞中的表达[9]。在参与基因转录后调控的多种顺式调控元件中，定位于mRNA 3'-UTR的ARE在基因表达调控中的作用研究得最多，多种ARE结合蛋白可通过与ARE元件的特异性结合而正向(如HuR蛋白)和(或)负向(如TTP蛋白)调控靶基因在细胞中的表达水平。此外，miRNA通过与3'-UTR结合而促进靶mRNA的降解和(或)翻译抑制也是近年来基因转录后调控的研究热点[7,10]。

前期研究表明，DUSP1是细胞炎症反应中的关键性负调控因子[11]。Hammer等[12]采用LPS刺激来源于DUSP1基因敲除(DUSP1-/-)小鼠的骨髓巨噬细胞，结果显示炎症相关的细胞因子如IL-6、IL-10、TNF、IL-1β和炎症趋化因子等的表达明显上调。但目前DUSP1基因调控细胞炎症反应的研究主要集中在转录水平，因此进一步探讨细胞炎症反应中DUSP1的转录后调控机制具有重要的理论与实践意义。近年来已有报道指出RNA结合蛋白通过与3'-UTR的特异性结合而调控DUSP1基因表达，如Lin等[13]在诱导3T3-L1前脂肪细胞分化的过程中发现RNA结合蛋白TTP可促进DUSP1 mRNA的降解，而Kuwano等[6]报道RNA结合蛋白HuR在细胞受到H2O2刺激时可上调DUSP1 mRNA的表达。此外，多种RNA结合蛋白如NF90、TIA-1、TIAR等均被发现可与DUSP1 mRNA的3'-UTR相互结合[6]，但它们对DUSP1基因表达的调控作用尚有待进一步验证。本研究通过生物信息学分析发现，DUSP1 3'-UTR含有3个ARE序列和4个潜在的miRNA结合位点，提示转录后水平的调控可能在DUSP1基因表达中具有重要地位。而本研究的初步结果也表明，将DUSP1 3'-UTR克隆至荧光素酶基因的下游可下调其在NIH3T3细胞中的表达，表明DUSP1 3'-UTR中含有负调控基因表达的顺式作用元件。

为了便于采用siRNA文库进一步筛选通过3'-UTR调控DUSP1基因表达的RNA结合蛋白及miRNA分子，本研究构建了含有DUSP1 mRNA的3'-UTR全长序列的双荧光素酶报告基因表达质粒，该质粒同时含有荧光素酶与海肾荧光素酶(RL)两个各自独立的表达模块，将其转染细胞后，可将海肾荧光素酶作为转染的内参照，从而降低不同样品核酸转染效率差异对实验结果的影响，同时由于海肾荧光素酶与荧光素酶基因位于同一个载体，其比例固定，便于不同批次实验结果的比较与统计。此外，本研究用荧光素酶及海肾荧光素酶的表达模块替换了慢病毒表达载体pLenti-TR中的TR表达模块，而保留了与慢病毒包装相关的所有元件，因此所构建的LuDP/RL载体可以通过慢病毒包装，所获得的假病毒可感染巨噬细胞等传统方法难以转染的细胞，有助于研究炎症刺激对DUSP1基因转录后水平调控的机制。本实验在NIH3T3细胞中分别共转染LuDP/RL与HuR表达载体和mmu-miR101a，结果与文献报道一致[6-7]，表明已成功构建了含有小鼠DUSP1 mRNA 3'-UTR的双荧光素酶报告基因表达载体，该载体不仅可用于验证DUSP1 3'-UTR中调控元件对DUSP1的影响，还可作为筛选与DUSP1 3'-UTR结合并对DUSP1有调控作用的RBPs和miRNAs的平台，为进一步研究DUSP1基因的转录后调控机制奠定了基础。

[1] Dong C, Davis RJ, Flavell RA. MAP kinases in the immune response[J]. Annu Rev Immunol, 2002, 20∶ 55-72.

[2] Li L, Chen SF, Liu Y. MAP kinase phosphatase-1, a critical negative regulator of the innate immune response[J]. Int J Clin Exp Med, 2009, 2(1)∶ 48-67.

[3] Liu Y, Shepherd EG, Nelin LD. MAPK phosphatases--regulating the immune response[J]. Nat Rev Immunol, 2007, 7(3)∶ 202-212.

[4] Caput D. Identification of a common nucleotide sequence in the 3'-untranslated region of mRNA molecules specifying inflammatory mediators[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1986,83(6)∶ 1670-1674.

[5] Shaw G, Kamen R. A conserved AU sequence from the 3'untranslated region of GM-CSF mRNA mediates selective mRNA degradation[J]. Cell, 1986, 46(5)∶ 659-667.

[6] Kuwano Y, Kim HH, Abdelmohsen K, et al. MKP-1 mRNA stabilization and translational control by RNA-binding proteins HuR and NF90[J]. Mol Cell Biol, 2008, 28(14)∶ 4562-4575.

[7] Zhu QY. MicroRNA-101 targets MAPK phosphatase-1 to regulate the activation of MAPKs in macrophages[J]. J Immunol,2010, 185(12)∶ 7435-7442.

[8] Hu SW, Sun MJ, Xia GX, et al．Construction and intracellular localization of eukaryotic expression vector transthyretin[J].Med J Chin PLA, 2009, 34(6)∶ 722-724.[胡水旺, 孙明晶, 夏高晓, 等. 转甲状腺素蛋白真核表达载体的构建及其细胞内定位[J]. 解放军医学杂志, 2009, 34(6)∶ 722-724.]

[9] Anderson P. Post-transcriptional control of cytokine production[J]. Nat Immunol, 2008, 9(4)∶ 353-359.

[10] Hu G. MicroRNA-98 and let-7 confer cholangiocyte expression of cytokine-inducible Src homology 2-containing protein in response to microbial challenge[J]. J Immunol, 2009, 183(3)∶1617-1624.

[11] Yin W, Mei ZZ. Dual specificity phosphatase-1∶ a negative regulator of inflammatory response[J]. Int J Immunol, 2012,35(5)∶ 338-340.[殷为, 梅柱中. 双特异性磷酸酶1∶ 炎症反应的负调控因子[J]. 国际免疫学杂志, 2012, 35(5)∶ 338-340.]

[12] Hammer M, Mages J, Dietrich H, et al. Dual specificity phosphatase 1 (DUSP1) regulates a subset of LPS-induced genes and protects mice from lethal endotoxin shock[J]. J Exp Med,2006, 203(1)∶ 15-20.

[13] Lin NY, Lin CT, Chang CJ. Modulation of immediate early gene expression by tristetraprolin in the differentiation of 3T3-L1 cells[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2008, 365(1)∶ 69-74.