蔡自峥，陆喦，柳新菊，缪云根

（1.浙江大学动物科学学院，浙江杭州 310058；2.浙江农业科学院蚕桑所，浙江杭州 310021）

家蚕抗药性的研究现状及其思考

蔡自峥1，陆喦1，柳新菊2，缪云根2

（1.浙江大学动物科学学院，浙江杭州 310058；2.浙江农业科学院蚕桑所，浙江杭州 310021）

环境污染和化学农药的广泛使用是影响农业生境的主要因素。家蚕由于长期的人工驯化和饲养，对农药和环境抗逆性差，可能成为抗药性和环境胁迫研究的指示生物，也是研究鳞翅目昆虫抗药性的理想生物之一。本文介绍了与抗药性相关的基因及主要解毒酶系；家蚕解毒酶系的表达特性及相关基因的克隆与功能研究现状。

家蚕；农药抗药性；解毒酶系；生物指标

环境污染和化学农药的广泛使用是影响农业生产环境的主要因素。家蚕（Bombyx mori）起源于野桑蚕（Bombyx mandarina），属昆虫纲鳞翅目蚕蛾科，以桑叶为食料的吐丝结茧的经济昆虫之一。由于长期的自然选择和农药的压力选择，家蚕和野桑蚕对不良环境和农药的抵抗能力存在很大的差异。与野桑蚕相比，家蚕对有机磷和菊酯类农药更加敏感，对农药和环境抗逆性差［1，2］。家蚕对环境污染的敏感性对一些新的化学药品进行高浓度急性和低浓度慢性生物毒性试验可以有效地评价这些化学物质的生态风险，可能成为抗药性和环境胁迫研究的指示生物，也是研究鳞翅目昆虫抗药性的理想生物之一。

1 家蚕作为研究昆虫抗药性的生物指标

家蚕作为鳞翅目昆虫的典型代表和理想的生物学模型对动物科学的发展起到了巨大的推动作用。相对于其他模式生物，家蚕还具有独特的优势：一是家蚕遗传资源十分丰富，具有大量形态突变和遗传致死及生理缺陷系统，其中胚胎和幼虫期突变尤为丰富；二是家蚕具有悠久的基础研究历史和现代科学研究基础，特别是目前已拥有详细的基因组生物信息支撑，并建有转基因等关键技术平台；三是家蚕重测序成果，为深入研究家蚕重要性状和进化历程提供了极为丰富的信息；四是家蚕作为重要的产业化生产的经济昆虫，众多数量遗传性状被系统深入地研究，家蚕的生理、病理、生化基础等也已被广泛深入地研究，其理论背景明确，并实现了人为控制发育。

家蚕对有害物质和以害虫为靶标的农药十分敏感。日本学者增井博之［3］利用无菌饲养的不同发育阶段家蚕进行重金属的毒性检测，通过测定半数致死剂量（LD50）观测蚕的变态、结茧和羽化过程等，对单一或混合重金属引起的毒性反应进行了分析，并对家蚕后代体内微量残留的重金属进行了检测。有研究，将杀灭天牛的有机磷农药MEP乳剂配制成低浓度药液（稀释至50000倍）后给家蚕幼虫添食，仍可观察到典型的中毒症状［4］。

2 与抗药性相关的主要酶及基因

昆虫的抗药性机制可分为靶标抗性和代谢抗性两种。靶标抗性是位点突变，而代谢抗性改变解毒蛋白水平或活性，它们单独或联合作用都可改变其抗性水平，有时会达到高抗，甚至对多类杀虫剂产生抗性［5］。大量研究表明，杀虫剂作用靶标的基因突变导致敏感性下降是害虫抗药性形成的重要机制，但还没有真正阐明其内在的机理和提出应对的策略。而且大多数研究集中在果蝇、家蝇和尖音库蚊这些病原传媒害虫以及棉蚜、棉铃虫、桃蚜等农业害虫中。

昆虫神经系统是昆虫体内最为重要的生理系统之一。它在昆虫的生长发育、变态调节以及各种行为等方面都发挥重要的作用，例如昆虫变态发育过程就是由神经系统激素调控的复杂生理过程。因此，杀虫剂作用靶点都集中于昆虫神经系统，作为杀虫剂靶点的主要有乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase，AChE）、乙酰胆碱受体（Acetylcholine receptor，AChR）、钠离子通道（Sodium channel）、GABA门控氯离子通道（GABA-gated chlorine channel）和激素调控系统蜕皮激素信号通路（Ecdysone hormone network）等。通过对靶点基因的研究，可以实现在基因水平阐释杀虫剂作用机理以及昆虫抗药性产生的分子机理。因此了解神经系统的结构和功能以及杀虫剂对神经靶点作用机制，是分析昆虫行为、药剂作用机理和研制新药剂的理论基础。

代谢抗性机制主要是通过解毒代谢酶基因扩增或过量表达，导致解毒代谢调节酶的活性显著升高，解毒代谢能力增强而对杀虫剂形成抗性。涉及代谢抗性解毒酶主要有细胞乙酰胆碱酯酶（AchE）、色素P450、非专一性酯酶和谷胱甘肽S-转移酶等。在这些酶中只要有一个酶的组成部分发生改变就可能改变对杀虫剂的解毒作用，但往往是联合发生作用。

乙酰胆碱酯酶（AchE）是有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的靶标。由于这2类药剂的广泛使用，目前已经有60种以上的昆虫对此靶标产生抗药性［6］。昆虫抗药性在分子水平上主要有2种机制，即基因突变和基因扩增。许多害虫的AchE基因发生突变与抗药性产生有密切关系，昆虫的AchE基因发生突变，其产物AchE发生变构，使得其对杀虫剂的敏感性降低，从而使昆虫产生抗药性。也有研究认为，抗性与AchE蛋白多态性的丢失相关［7，8］。

细胞色素P450是昆虫体内参与种类杀虫剂和其它内、外源化合物代谢的主要解毒酶系，在生物体内氧化代谢中起着关键的作用。它与氧分子和底物结合，决定着整个系统的底物专一性，并参与氧的活化。相关的P450基因表达及催化活动发生变化，被认为是昆虫对杀虫剂产生抗药性的主要机制之一。P450基因足一个超级家族，当前已知该超基因家族包括36个基因族［9］。在昆虫中已克隆了4个基因家族，分属于Cy、Cy、C'，JP9和CYP18家族，其中属于C'，家族的Cy，CYP6A2、CYP6A8、CYP6A9、CYP6B1和CYP6D1等基因已被证实或推测与昆虫抗药性有关［10］。对菊酯类杀虫剂产生抗性的果蝇和其它害虫与Cy基因的过量表达有关［5］。

除此之外，非专一性酯酶（ESTs）、谷胱甘肽-S-转移酶（GST）也相继被发现是是昆虫体内杀虫剂的主要解毒酶。

从目前研究来看，靶标抗性的AchE、SC及GABA受体一般都与结构基因的点突变有关。而代谢抗性与相关的P450基因增强表达有关，与ESTs基因突变、基因扩增及转录有关，并与GST基因扩增及调节有关。

3 家蚕解毒酶系的表达特性及相关基因的克隆与功能研究现状

家蚕存在两种乙酰胆碱酯酶基因，即乙酰胆碱酯酶1（Bm-acel）与乙酰胆碱酯酶2（Bm-ace2）。其中Bm-acel基因全长3851bp，含有2个内含子，基因编码区全长2052bp，编码约683个氨基酸残基。Bm-ace2基因全长2700bp，约含5个内含子，编码区长为1917bp，编码一个638个残基的氨基酸，预测含有一个约23个氨基酸残基的信号肽。

在家蚕发育的各个时期Bm-ace1的表达量均高于Bm-ace2。他们都表现出先下降后上升的总体趋势，其中Bm-ace1在3龄家蚕的表达量达到最低，而Bm-ace2在2龄期家蚕最低。Bm-ace1和Bm-ace2表达量都在家蚕的脑部和脂肪体相对于其他组织要高，Bm-ace1在中肠有少量表达，而Bm-ace2在丝腺中少量表达。

Seino（2007）等对家蚕两种类型ace基因的cDNA进行了克隆分析［11］。Shang（2007）等在真核细胞内表达了家蚕的Bm-ace1、Bm-ace2，结果表明，Bmace2的真核表达产物对有机磷农药较敏感［12］。

细胞色素P450对昆虫的生长发育、环境适应性以及抗药性具有至关重要的作用。P450蛋白种类的多样性及其底物的重叠性使P450酶系可以催化生物体内多种类型的反应，不仅对许多外来物质如杀虫剂及其它环境有毒物质具有代谢作用，还参与一些起主要生理功能的内源性物质如激素、脂肪酸的代谢［13］。

在昆虫中已报道28个细胞色素P450基因家族和数百个细胞色素P450基因。其中可能与抗药性相关的基因主要集中在CYP6和CYP9家族，家蚕CYP9A22基因包含9个内含子，长度分别为1028、384、208、279、1410、2722、702、1216、1377 bp，其两端符合GT-AG规则［14］。家蝇（Musca domestica）对有机磷抗药性相关的基因为CYP6A-l［15，16］、对拟除虫菊酯抗药性相关的CYP6D1［17，18］，果蝇对DDT抗药性相关的CYP6G1［19］，烟芽夜蛾对拟除虫菊酯抗药性相关的基因CYP9A1［20，21］等。因此，一个或几个P450基因过量表达引起P450解毒酶量的增加是导致昆虫对杀虫剂产生抗药性的重要原因之一［22，23］。

在氯氰菊酯诱导的诱导作用下，对5龄家蚕幼虫的中肠和脂肪体，采用半定量RT-PCR方法检测其中各CYP9A22基因mRNA的转录水平。实验结果表明，在未进行氯氰菊酯诱导的作用下，CYP9A22在中肠中的表达量远高于脂肪体中，在未进行氯氰菊酯诱导的作用下，CYP9A22基因在中肠中的表达量相近，在脂肪体中有明显差异。

研究表明，谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase，GST）是由多基因编码的蛋白质，主要功能是催化谷胱甘肽（glutalhione，GSH）的巯基与一些亲电子类有毒物质（如杀虫剂、醌类化合物及过氧化物等）进行轭合反应（conjugation reaction），从而保护DNA及一些蛋白质免受损伤［24］。

根据在细胞中的定位，可以将GST分为微粒体型、线粒体型和胞质型三大类型。胞质GST的数量繁多，且与昆虫的抗药性密切相关，因此得科学工作者的广泛研究。家蚕23个胞质GST中有GSTd4、GSTe7和GSTe8这3个基因的CDS区预测还不完整，其中有19个GST基因已经有相应的表达证据。家蚕中Delta家族有4个基因，除不完整的GSTd4外，其他基因的氨基酸序列的一致性为43.2～61.8%［25］。2010年，赵国栋等［26］选择家蚕GST基因从分子水平上研究家蚕体内的解毒机制和抗性机制，以实时荧光定量PCR的方法分别检测了BmGSTdl基因在正常饲养及添食NaF的情况下家蚕5龄幼虫不同组织中的转录水平，结果证实添食NaF后中肠和脂肪体中BmGSTdl基因的转录水平明显提高，可能是由于这2种组织是家蚕的主要解毒器官。余泉友［25］等在家蚕基因组中共鉴定出8个Epsilon家族的基因，其中BmGSTe3与小菜蛾中有机磷抗性相关基因中的PxGST3有着近52.7%的氨基酸序列一致性，在进化上距离较近，可能为其直系同源基因。许湲［27］和刘佳［28］分别于2008年和2009年克隆并表达了家蚕BmGSTe3和BmGSTe4基因，并对表达产物进行了真核表达，研究结果表明BmGSTe3基因的表达具有较高的组织特异性，只能在血淋巴和头部中有表达，而BmGSTe4只在表皮和头部中表达。余泉友等［25］以按蚊等昆虫的微粒体GST与家蚕基因组比对后分析表明，家蚕有两个微粒体GST基因，命名为BmGSTmic1和BmGSTmic2，家蚕这两个微粒体GST基因具有高度的保守性，其氨基酸一致性高达65.3℉。2007年，侯成香等［29］研究了家蚕GST活性的组织分布以及发育阶段的变化规律及不同类型中家蚕品种间GST的活性差异，结果表明在5龄期家蚕幼虫的脂肪体、中肠、血淋巴、表皮和头部都检测到了GST，其中在脂肪体和中肠中GST活性较其他组织中的高出很多。

近年来，昆虫的抗药性日益严重，造成大量的药物残留，给人们的人身安全带来了不可估量的危害。家蚕作为一种模式生物，其对环境污染和对一些新的化学药品的敏感性研究，可能成为抗药性和环境胁迫研究的指示生物。

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Research Progress and Biological Feasibility on Resistance of Silkworm to Pesticides

CAI Zi-zheng1，LU Yan1，LIU Xin-ju2,MIAO Yun-gen1
（1.College of Animal Sciences,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China; 2.Sericultural Institute,Zhejiang Academy of Agricultural Sciences,Hangzhou 310021,China）

Environmental pollution and the widespread use of chemical pesticides have become the main factors which affect the agricultural habitats.Due to the long-term artificial domestication and breeding,silkworms have a low stress resistance to the pesticides and the environment,which become one of the ideal biological indicators to study the pesticides or insecticides resistance.This article described the genes related to the resistance and main detoxification enzymes,characteristics and gene cloning and function of silkworm detoxification enzyme.

silkworm;resistance to the pesticides;detoxification enzymes;biological indicator

S886.7

C

0258-4069[2013]01-

教育部博士学科点专项科研基金（编号：20110101110100）；浙江科技计划公益技术应用研究农业项目（课题编号：2012C22048）

作者介绍：蔡自峥，女（1988-），河南信阳人，硕士研究生，主要从事蚕桑资源极其分子生物学研究。E-mail:caizizheng911@126.com

缪云根，男，教授。E-mail:miaoyg@zju.edu.cn