许 翠，高梦祥 （长江大学生命科学学院，湖北 荆州434025）

微生物具有独特和高效的生物转化能力，能产生多种代谢产物，其产物中的一些生物活性物质 （如抗生素、氨基酸、糖肽等）在医药、食品和化工工业中有着不可取代的地位［1］。然而，通常从自然界分离得到的野生菌株代谢产物产量往往很低，远不能满足工业生产的需要，因此微生物应用的难题集中到如何对菌种进行改良，以获得高产高效的优良工业菌株。而微生物育种的目的就是要人为地使某些代谢产物过量积累，把生物合成的代谢途径朝着人们所希望的方向加以引导，获得所需要的高产、优质和低耗的菌种［2］，以降低生产成本［3］。微生物诱变处理一般采取物理诱变方法，如紫外线 （UV）、X射线等和化学诱变方法如碱基类似物、烷化剂甲基磺酸乙酯 （EMS）等传统方法。但是，这些方法具有耗时、费力、工作量大以及诱变结果不具定向性等缺点。随着生命科学技术的发展以及学科交叉的深入，基因工程、原生质体融合和生物信息学等的应用日益广泛，使得菌种改良技术得到了不断的发展和创新，从而为筛选得到更多优质、高效菌种提供了技术上的可能和便利［4］。为此，笔者综述了近年来国内外出现的微生物菌种诱变新技术以及新的筛选方法在微生物菌株选育中的应用，旨在为微生物菌种诱变筛选等相关研究提供启迪和参考。

1 诱变育种技术

1．1 离子注入诱变育种

离子注入诱变是集物理诱变、化学诱变为一体的综合诱变方法，1986年由中科院等离子体所率先将低能离子束技术应用于诱变育种［5］。该技术是利用离子注入设备对生物体进行离子注入，注入的离子对细胞的刻蚀可使细胞由表及里形成微孔或洞，生物分子吸收能量并引起多类活性自由基的复杂变化，从而引起染色体的畸变，导致DNA链碱基的损伤、断裂［6］，最终导致遗传物质的永久改变，然后从变异菌株中选育优良菌株。该技术应用于微生物诱变育种时具有损伤轻、突变率高、突变谱广、变异幅度大、性状稳定等特点［7］，其所选用的离子一般为气体单质的正离子，其中以N＋最多，近年来在工业微生物优良株的诱变选育或改良中取得了较大的成功。李颖颖等［8］对新鲜灵芝孢子进行低能N＋注入，筛选到了1株灵芝高产菌株GL1026，其灵芝子实体产量、多糖含量、三萜含量分别较对照菌株提高了15．94%、9．68%、17．60%。王瑶函等［9］以链霉菌NJWGH1322为研究对象，利用N＋低能离子注入、亚硝酸钠 （NaNO2）进行诱变，最终筛选出1株产量突变提高43．1%的高产菌株，经5次传代试验表明该菌株遗传稳定性较好。陈丽娟等［10］以青贮玉米中选育获得的植物乳杆菌ANCLA01作为出发菌株，采用单粒子精确定位注入技术对其进行氮离子注入，筛选获得正向突变菌株ANCLA02，氮离子的注入使植物乳酸杆菌的共轭亚油酸 （CLA）产量从33．44μg／ml提高到66．67μg／ml，且变异菌株经传5代培养后产CLA稳定。

1．2 原生质体融合育种

原生质体融合技术 （Protoplast fusion）是起源于20世纪60年代的一项重要的菌种改良技术，是将亲株细胞分别去除细胞壁后在高渗条件下辅以物理、化学或生物手段进行融合，经基因组间的交换重组，获得融合子的过程［11］。原生质体融合可以使亲本细胞随机融合，有效地筛选具有亲本特性的优良融合菌株，为遗传育种提供了一种有效手段，已广泛应用于微生物育种工作的各个方面 （如高产菌株选育，多功能菌株选育等）。Xu等［12］以始旋链霉菌 （S．pristinaespira lis）CGMCC0957突变菌中普纳霉素产量最高的4株菌为亲本进行原生质体融合，得到的优良菌株的普纳霉素产量达到0．89g／L，比亲本高89．4%。Jin等［13］以10株产量较高的多杀菌素产生菌 （Saccharopolyspora spinosa）为出发菌株，经过融合，得到高产菌株4～7株，其产量可达到547mg／L，较出发菌株提高了200．55%以上，在5L发酵罐中发酵168h，多杀菌素产量可达到428mg／L。张欢等［14］以酿酒酵母Y518为出发菌种，基于多亲本原生质体融合技术，通过4轮原生质体融合，得到2株GSH产量提高的酿酒酵母突变菌株，最高产量可达15．92mg／g，为原始菌株的2倍。张禹等［15］选取具有草酸分解能力的乳双歧杆菌和具有耐氧特性的嗜酸乳杆菌作为亲本，通过双亲灭活进行原生质体融合，融合率可达7．6%。从中筛选出同时具有耐氧特性和草酸分解能力的融合子，草酸分解率为13．4%。

1．3 基因工程诱变育种

基因工程育种是在分子水平上对基因进行操作，人为将所需的某一供体生物的遗传物质提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，与载体连接，然后导入另一细胞，使外源遗传物质在其中进行正常复制和表达［16］，从而获得新物种的一种崭新技术。该技术克服了传统育种技术的随机性和盲目性，可以完全突破物种间的障碍，进行定向变异和育种，在微生物菌种改良方面具有广阔的应用前景。近年来，随着基因工程和现代分子生物技术的快速发展与突破，基因组改组技术、基因敲除技术等新方法的应用也日益广泛。

基因组改组技术又叫基因组重排 （genome shuffling）是近几年发展起来的一种新型微生物体内分子育种方法，其通过传统微生物诱变育种与原生质体融合技术的有效结合，使得不同菌株的全基因组进行随机重组，进而极大提高菌种的正突变频率，使得人们能够在短时间内选育到理想菌株［17－18］。该技术应用时无需事先了解亲本菌株详细的遗传背景即可实现微生物的定向进化［19］，使之成为了一种极其高效的微生物育种手段。王景会等［20］以4株诱变的枯草芽孢杆菌菌株为亲本，采用PEG介导的方法进行两次多亲本的全基因组改组，共筛选出3株酶活力大幅度提高并能稳定遗传的优良菌株，酶活力最高2175．81U／m L，达到原始菌株的3．01倍。王大红等［21］以纤维堆囊菌AHB125为原始菌株，以经过紫外诱变和2%乙酸钠抗性筛选出来的SC4－14和SC4－56为出发菌株，通过4轮基因组重排成功选育出了5株遗传稳定的埃坡霉素B（Epothilone B）高产菌株，其中1株重排菌株F4－28埃坡霉素B产量达到67．4mg／L，是原始菌株产量的8倍，是两亲本菌株埃坡霉素B产量的4～5倍。

基因敲除 （gene knockout）是20世纪80年代发展起来的一项重要的分子生物学技术，其利用DNA转化技术，将含有目的基因和靶基因同源片段的重组载体导入靶细胞，通过载体与靶细胞染色体上同源序列间的重组，将外源基因整合入内源基因组内，使外源基因得以表达［22］。随着对微生物代谢机理认识的不断加深，利用基因敲除技术可阻断微生物细胞的代谢旁路，进行微生物基因的结构和功能相关研究，或通过引入突变位点降低或阻断副产物的合成，提高产物的纯度，从而改变目的产物的产量或质量，改良工业生产菌株，达到微生物育种的目的［23］。佐一含等［24］通过敲除啤酒酵母中β－丙基苹果酸脱氢酶基因 （LEU2），筛选获得的突变株发酵液中高级醇含量比出发菌株降低了9．97%，其中异戊醇的含量降低了11．82%，而酒精度、发酵速度等发酵性能没有明显变化。Steen等［25］在大肠杆菌K系列菌株中敲除了脂酰辅酶A合成酶的基因 （fad D和fad E基因），并过量表达大肠杆菌硫酯酶，筛选得到高产突变株，其脂肪酸产量达到1．2g／L。

1．4 其他诱变方法育种

磁场生物学效应是生物磁学领域的一个研究热点。磁场作用于生物体的最直接效应可能是影响膜内电场变化、细胞膜及跨膜信息传递活性、细胞酶活、自由基基团等，进而引起生物大分子 （如DNA）造成损伤，使生物产生基因的损伤和突变等效应，从而间接影响基因的转录与表达［26］。尽管电磁场对微生物基因表达的作用机制目前尚不清楚，但国内外已有大量关于磁场作用于微生物菌株的研究。高梦祥等［27］利用磁场处理啤酒酵母，发现磁场强度0．563A／m和0．669A／m作用时间2h时，磁场对啤酒酵母促进作用最强，其菌液浓度增长了34．01%。磁场处理猴头菌，发现磁场强度为0．8A／m，作用时间为24h时，胞外多糖的生长促进作用最强，猴头菌胞外多糖质量浓度增长率达187．5%［28］。Ozden等［29］研究极低频磁场对粘红酵母产转化酶产量的影响，结果表明，7m T磁场处理组的生物量较对照组增加了14%～28%，处理组较对照组转化酶产量增加了48%～67%。基于磁场对微生物菌株生长和代谢产量的促进作用，使得磁场可以作为微生物菌种诱变研究中的有效手段。在微生物育种中也用到其他诱变技术，如空间、激光、微波等诱变方法。

2 筛选方法

筛选得到目标微生物菌种是微生物育种的最终目的。通过各种诱变手段改变菌体的遗传性状后，如何从数量庞大的菌体族群中筛选特异性目标菌种，是育种上最关键也最耗时费力的工作，筛选在一定程度上是决定菌种选育效率的关键步骤［16］。

2．1 抗性筛选法

微生物的某些抗生素抗性突变会直接影响其产物的代谢调控系统［30－31］，从而改变突变株代谢产物的产量，因此抗性筛选法可用于有用产物生产菌优良菌株的选育和改良。抗生素抗性筛选是基于微生物对抗生素产生耐药性发展起来的菌株选育技术，因其实验操作简便、效果显著而在有用微生物菌株选育中得到广泛应用［32］。而筛选方法一般包括单一抗性筛选如链霉素抗性筛选，多种抗生素的多重抗性筛选，以及与其他诱变技术相结合的抗性筛选。

张智翔等［33］以玫瑰孢链霉菌 （Streptomyces roseosporus）ATCC 11379为出发菌株，通过在不同浓度梯度的达托霉素和链霉素复合抗性平板上进行抗性筛选，结果筛选到一株高产达托霉素的突变株D1000－S3－2，经摇瓶发酵验证达托霉素发酵单位可达59mg／L，比出发菌株提高了63．8%。刘垚等［34］以经紫外线诱变处理过的博来霉素产生菌为对象，应用链霉素抗性筛选法获得了151株链霉素抗性突变株，并获得一株产抗生素能力为出发菌株约1．25倍的突变株。阿维菌素高产菌株Y0910－67的筛选就是以Y0909－12为原始菌株，经过亚硝基胍诱变后，采用链霉素进行抗性筛选得到的，其效价较对照高出16．9%［35］。

2．2 荧光筛选法

荧光标记技术是一种非放射性的标记技术，是指利用一些能发荧光的物质共价结合或物理吸附在所要研究分子的某个基团上，利用它的荧光特性来提供被研究对象的信息［36］。近年来，荧光标记技术取得了迅速的发展，广泛应用于原生质体融合子的筛选、微生物菌株筛选、细胞内外物质检测等方面，在微生物学研究领域里发挥了很大的作用。

荧光染色标记是一种非人工遗传标记，其可用于标记原生质体来筛选融合子菌株。在制备原生质体时，使双亲株原生质体带上不同的荧光色素，原生质体融合后，直接筛选出带有两色荧光的融合子即可。龙建友等［37］在链霉素No．24菌株及其诱变株Ms－24菌株的原生质体悬浮液中分别加入酚藏花红和伊文思蓝2种荧光色素进行标记，将带有红、蓝荧光色素的亲本原生质体融合，然后在荧光显微镜下直接筛选同时带有红蓝荧光的融合子。利用荧光染料进行标记分析，操作简便、高稳定性、高灵敏度、高选择性，而且还可以大大缩短融合的工序和时间，提高筛选融合子的效率，是一种快捷、高效的的筛选方法，现已被众多研究者广泛使用。

荧光素酶是生物组织体内由于代谢活动催化荧光素或脂肪醛氧化发光的一类酶的总称，其可用于标记基因、细胞和活体动物。标记方法是通过分子生物学克隆技术，将荧光素酶基因插到预期分析的细胞染色体内，通过单克隆细胞技术的筛选，培养出能稳定表达荧光素酶的细胞株［38］。Vesterlund等［39］利用细菌的荧光素酶基因克隆到金黄色葡萄球菌，大肠杆菌和沙门氏菌等指示菌中，使得指示菌具有荧光酶基因lux AB和负责合成长链脂肪醛的luxCDE基因，用于产生荧光，可以快速检测并筛选出具有抗菌作用的菌株，且该方法已经用于快速筛选具有抗菌活性的乳酸菌［40］。该方法具有快速、准确等优点，可以在1～2h内得到结果，是一种快捷、高效的的筛选方法。

2．3 基于PCR的快速筛选法

PCR即聚合酶链式反应 （Polymerase Chain Reaction，PCR），是美国PE－Cetus公司的科学家Kary Banks Mulis于1985年发明的一种可在体外快速扩增特定基因或DNA序列，并在短时间内可获得大量特异DNA序列拷贝的新技术。由于PCR技术可快速特异地扩增任何期望的DNA片段或目的基因且操作简便、特异性和灵敏度高、结果可靠，所以其自1985年问世以来至今得到了迅速发展，该技术已广泛用于微生物学、分子生物学、生物工程和生物分类学等领域中。随着现代分子生物技术、基因组测序和生物信息学等的快速发展与广泛应用，使得基于PCR方法的快速筛选可以作为微生物菌种筛选研究中的有效手段，可以快速筛选出所需的目标菌种。

随着不同乳酸菌菌株基因组测序的完成及乳酸菌代谢产物编码基因等生物信息的丰富，Michat等［41］根据已知的class IIa型细菌素的编码基因，设计了编码class IIa细菌素基因的7对保守的PCR引物，利用PCR方法从40种奶酪样品中筛选出了产class IIa细菌素的乳酸菌。张红发等［42］在基因序列数据库中查找益生双歧杆菌的16Sr DNA共有序列，找出它们共有的特异性序列，设计了PCR引物，平板培养分离，初步筛选双歧杆菌菌落。根据细菌16Sr DNA和23S r DNA两侧高度保守区域设计通用引物，提取菌落基因组DNA，扩增16S－23Sr DNA间区序列，并送测序。通过3轮PCR及序列同源性比对分析鉴定，从人体定向筛选到长双歧杆菌。传统筛种方法具有随机性、盲目性，而PCR筛菌增加了目的性和效率，给筛菌工作带来了很大的便利。

虽然PCR技术的筛选方法具有灵敏、快速、简单等优点，但是在实际操作过程中所利用的特异性引物的特异性上很难把控，需要在其特异性靶点上下功夫，才能保证较高的扩增产物浓度。

3 结语

微生物育种中的诱变和筛选环节极为繁杂，尤其是筛选工作量很大，寻找快速、有效的高通量筛选平台至关重要。在微生物菌种选育生产实践中可根据不同菌种的特点及生产需求，选择不同的诱变技术和筛选方法。随着遗传学和分子生物学领域的飞速发展，基因组学、蛋白质组学及生物信息学的应用日益广泛，相信许多新型高效的技术将被应用于菌种诱变筛选，创造出更多有利于发酵工业生产的微生物新品种，大大推动工业微生物菌种改良筛选技术的发展，为微生物工业带来新的希望。

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