张 欣 于瑞祥 杨瑞钰 方晓明 丁卓平

（上海海洋大学食品学院1，上海 201306）

（上海市标准化研究院2，上海 200031）

（上海出入境检验检疫局3，上海 200135）

角鲨烯常温下为无色油状液体，是一种高度不饱和脂肪族烃类化合物。其最初是从鲨鱼的肝油中发现的，1914年被命名为Squalene，其化学名称为2，6，10，15，19，23－六甲基 －2，6，10，14，18，22－二十四碳六烯，属开链三萜，又称鱼肝油萜，也称鲨烯［1］。角鲨烯不仅具有促进新陈代谢，活化细胞、强化内脏的作用，还具有强烈的抗氧化作用，能有效地防止细胞的老化和癌变、抗癌、防癌，提高机体的免疫力。目前，角鲨烯主要来自于深海鲨鱼肝油，同时也少量存在于油脂不皂化物中，尤其在橄榄油、棕榈油及其脱臭馏出物中含量较多，菜籽油、大豆油、米糠油、棉籽油等植物油也含有一定量角鲨烯［2］。

目前，关于角鲨烯的检测分析以气相色谱法居多［3－5］，也有采用高效液相色谱法进行测定，如陈全斌等［6］在检测罗汉果种仁油中的角鲨烯时，将油用氯仿定容后直接进行高效液相色谱分析。Murkovic等［7］采用高效液相色谱法分析橄榄油中角鲨烯含量，样品除稀释之外未做任何前处理，这样不仅对色谱柱易造成损害，降低仪器灵敏度，而且样品中较多杂质的存在对目标物质的判断产生干扰。Nenadis等［8］用高效液相色谱法测定橄榄油中角鲨烯时，将样品用甲醇／乙腈（体积比为7∶3）的混合溶液提取，经24 h冷冻后取上清液过滤，溶剂蒸发后所得的残余物用乙腈定容，虽其对样品进行了前处理，但是花费时间过长。

本研究建立了硅胶柱提取、HPLC法测定植物油中角鲨烯的方法，该方法准确、灵敏、可靠，测定低限（LOQ）为 5．0 mg／kg，与 Nenadis等［8］的定量检测限（79 mg／kg）相比更低、更灵敏。本方法已应用于实际样品分析，对于植物性角鲨烯的开发及应用具有重要意义。

1 材料与方法

1．1 试剂和仪器

角鲨烯标准品：纯度≥98%，美国Sigma公司。

石油醚：色谱纯，沸程35～60℃，加拿大Caledon公司；正己烷：色谱纯，美国 J．T．Baker公司；乙腈：色谱纯，加拿大Caledon公司；叔丁基甲醚：色谱纯，美国Sigma公司；无水硫酸钠：分析纯，国药集团化学试剂有限公司，于500℃烘4 h以上，冷却后储存于干燥器中备用；硅胶60：0．063～0．200 mm，德国 Merck公司，于450℃烘5 h以上，冷却后加入2%水，混匀，转移至广口试剂瓶中，盖塞备用；水为超纯水。

2695型高效液相色谱仪：美国Waters公司，配2487型紫外检测器；N－EVAP111型氮吹仪：美国Organomation公司；硅胶柱：国药集团化学试剂有限公司，为带活塞的砂芯玻璃层析柱（φ10 mm×250 mm），加3．0 g硅胶，顶端加0．5 cm无水硫酸钠。

1．2 试验方法

1．2．1 标准溶液的配制

准确称取100 mg角鲨烯标准品于100 mL容量瓶中，用正己烷定容至刻度，摇匀，得到1．0 mg／mL角鲨烯标准储备液。

1．2．2 样品处理

称取植物油样品0．50 g于小烧杯中（精确至0．001 g），加入5 mL石油醚，混匀，倒入硅胶柱中，然后重复2次用5 mL石油醚润洗烧杯，洗涤液一并倒入小柱中，当石油醚液面与上端无水硫酸钠层相切时，加入30 mL石油醚，收集全部的45 mL洗脱液至50 mL收集管中，用氮吹仪氮吹至干，随后用正己烷定容至2．0 mL（橄榄油与油橄榄果渣油用正己烷定容至4．0 mL），保鲜膜封口（防止正己烷挥发），充分振摇，转移到进样小瓶，待测。

1．2．3 液相色谱条件

Kromasil 100－5C18柱（250 mm×4．6 mm），乙腈／叔丁基甲醚（75＋25，V／V）作流动相，紫外检测波长210 nm，柱温25℃，流速1．0 mL／min。

2 结果与讨论

2．1 硅胶柱净化

2．1．1 2种湿法装柱的比较

第1种是将称量好的硅胶置于烧杯中，加入石油醚，搅拌，硅胶随石油醚倒入小柱中，保持柱中硅胶填料被石油醚完全浸润，然后柱上端加入约0．5 cm无水硫酸钠。第2种是将称量好的硅胶倒入事先装有约25 mL石油醚的小柱中，静置片刻，再加入0．5 cm无水硫酸钠，打开塞子，使石油醚缓慢淋洗下来。2种方法相比较，前者在淋洗过程中，柱中易产生气泡和间隙，洗脱过程容易断裂，装柱重复性较差，样品回收率偏低；而后者，柱中硅胶填料均匀，不易出现气泡和断层现象，流速稳定，重复性和回收率均好，故选择后面一种湿法装柱。

2．1．2 柱净化效果

文献报道的高效液相色谱法测定植物油中角鲨烯，通常采用溶剂稀释后直接进样的方法［6－7］。图1a为豆油用正己烷稀释10倍后直接进样的色谱图，由图1a可以看出，过多的杂质峰对角鲨烯的峰形产生干扰，此外，直接进样的方式会对色谱柱等造成一定程度的污染。为了改善角鲨烯的峰形，减少对色谱柱等的污染，提高仪器检测灵敏度，本研究采用硅胶柱提取植物油中角鲨烯，图1b为豆油分离色谱图。由图1b可见，经硅胶柱提取／净化后，角鲨烯获得基线分离，没有杂质峰干扰，大大提高了检测灵敏度。

图1 豆油色谱图

2．2 流动相的选择

分别考察了乙腈／甲醇、乙腈／叔丁基甲醚对分离体系的影响，采用乙腈／甲醇（40＋60，V／V）作流动相时，在流速为1 mL／min的条件下，角鲨烯的出峰时间过长（约41．7 min），调整二者之间的比例仍达不到理想效果。叔丁基甲醚作为有机溶剂既利于脂溶性的角鲨烯在流动相中的溶解，加速待测物质的洗脱，又能防止其他脂溶性的大分子物质在柱中的沉淀，延长色谱柱寿命，因此，尝试在乙腈中添加叔丁基甲醚作为流动相。以乙腈／叔丁基甲醚（75＋25，V／V）作为流动相时，角鲨烯出峰时间较早，且其附近无干扰，具有较好的分离效果，色谱图如图1b所示，角鲨烯的保留时间为12．9 min。

2．3 标准曲线

分别取适量1．0 mg／mL角鲨烯标准储备液，用正己烷配制系列标准工作溶液，质量浓度分别为2．0、10．0、50．0、100．0、250．0、500．0和 1 000 mg／L。按选定的色谱条件，取10μL进样，以峰面积（y）对质量浓度（x）进行线性回归，结果表明，在上述浓度范围内呈良好线性，回归方程为y＝36 031x＋4 481，线性相关系数（R2）为0．998。

2．4 回收率、精密度和检测限

豆油中角鲨烯含量较少，因此选择它作为添加回收试验的样品。样品的添加量分别为5．0、100、500和1 000 mg／kg，每一添加水平的样品数为8个，样品处理和测定按1．2．2节和1．2．3节进行。先测定样品中角鲨烯的本底含量，再分别测定添加样品角鲨烯的含量，扣除空白值后，计算添加回收率，加标样品的回收率及精密度结果见表1。由表1可见，平均添加回收率为82．4%～89．3%间，相对标准偏差（RSD）＜7．1%（n＝8）。

以能准确测定的最低浓度确定为测定低限（LOQ），本方法的 LOQ为5．0 mg／kg。

表1 加标样品的回收率及精密度（n＝8）

2．5 实际样品分析

表2 各种植物油中角鲨烯含量

本方法对13种市售植物油样品进行分析，各样品中角鲨烯含量见表2。从测定结果可以看出，特级初榨橄榄油和油橄榄果渣油中的角鲨烯含量明显高于其他植物油，是植物性角鲨烯的良好来源。

3 结论

本试验建立的硅胶柱提取，HPLC法测定植物油中角鲨烯的方法，样品经硅胶柱提取／净化，样品回收率高、净化效果好，减少了对色谱柱的污染，角鲨烯达到基线分离，避免了干扰组分对被测物峰的影响，大大提高了检测灵敏度，较文献方法灵敏、可靠，本方法已应用于实际样品的分析。

［1］吴立军．天然药物化学［M］．北京：人民卫生出版社，2003：222

［2］官波，郑文诚．角鲨烯提取、纯化及其应用［J］．粮食与油脂，2010（2）：44－46

［3］廖杰，赵玉兰，李宁，等．植物油中角鲨烯的 GC／MS分析［J］．现代仪器，2008（5）：36－37

［4］钟冬莲，汤富彬，沈丹玉，等．油茶籽油中角鲨烯含量的气相色谱法测定［J］．分析试验室，2011，30（11）：104－106

［5］唐小红，陈华勇，王永华，等．气相色谱质谱联用测定深海鱼油中角鲨烯含量［J］．油脂工程，2012（1）：50－53

［6］陈全斌，程忠泉，杨建香，等．罗汉果种仁油中角鲨烯的高效液相色谱分析［J］．广西科学，2006，13（2）：118－120

［7］Murkovic M，Lechner S，Pietzka A，et al．Analysis of minor components in olive oil［J］．Journal of Biochemical and Biophysical Methods，2004，61（1－2）：155－160

［8］Nenadis N，Tsimidou M．Determination of squalene in olive oil using fractional crystallization for sample preparation［J］．Journal of the American Oil Chemists’Society，2002，79（3）：257－259．