扶庆权，侯 佩，陈 能

(1.南京晓庄学院生物化工与环境工程学院，江苏 南京 211171；2.四川大学生命科学学院，四川 成都 610064)

响应面法优化芦蒿叶总黄酮的提取工艺

扶庆权1，侯 佩2，陈 能1

(1.南京晓庄学院生物化工与环境工程学院，江苏 南京 211171；2.四川大学生命科学学院，四川 成都 610064)

以芦蒿叶为原料提取黄酮类物质。在单因素试验的基础上，采用响应曲面法研究提取温度、乙醇溶液体积分数、料液比和提取时间对芦蒿叶总黄酮得率的影响，并建立该工艺的二次多项式模型。结果表明：回归模型具有高度显著性，可对芦蒿叶总黄酮得率进行有效分析和合理预测；各因素对得率的影响大小顺序依次为提取时间＞乙醇溶液体积分数＞料液比＞提取温度；有机溶剂回流提取芦蒿叶总黄酮的最佳工艺条件为乙醇溶液体积分数70%、提取温度80℃、料液比1:100(g/mL)、提取时间180min，在此条件下总黄酮得率为6.58%。

芦蒿；总黄酮；提取工艺；响应曲面法

芦蒿，又名萎蒿、藜蒿、水蒿、狭叶蒿、柳蒿等，为多年生菊科蒿属草本植物，原产于亚洲，主要分布于我国长江中下游地区及东北、华北和中南地区。芦蒿富含氨基酸，且谷氨酸占总氨基酸含量的24.42%[1]，含有的测柏莲酮芳香油具有独特风味，此外，微量元素硒的含量是芦荟的10倍[2]。芦蒿叶类黄酮是芦蒿叶中最重要的生物活性物质之一，类黄酮作为天然的抗氧化剂具有抗肿瘤、延缓衰老、降血糖、降血脂、抗氧化、消除体内自由基、增强免疫力、抗菌、抗病毒及保护心脑血管等多种功效[3-11]。我国芦蒿资源十分丰富，仅南京市八卦洲现有芦蒿种植面积2.2×102km2，年产芦蒿3万t[12]。若将芦蒿叶充分利用来提取黄酮类物质，既可以增加芦蒿产业的附加值，又可以保护环境，具有较好的经济意义和价值。本实验通过响应曲面试验优化芦蒿叶中总黄酮的提取工艺条件，为提高芦蒿叶的利用率和工业化生产高附加值的总黄酮提供实验参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

芦蒿叶采摘自南京江心洲芦蒿种植基地，采摘后晒干粉碎备用。

芦丁标准品 中国食品药品检定研究院；氢氧化钠、无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝等(均为分析纯) 南京化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

7230G型可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司；AUY120型电子天平 日本岛津公司；HH-4型数显恒温水浴锅 国华电器有限公司；TDL-型台式离心机 上海安亭科学仪器厂；SHB-III 型循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取液制备

取芦蒿叶粉末2.0000g，按预先设计好的实验方案用一定体积分数和体积的乙醇溶液于一定温度回流提取一定时间，提取液趁热抽滤，滤渣弃去，收集滤液并精量其体积，记录数据。总黄酮含量的测定：精密移取2.00mL离心后的提取液置于25mL容量瓶中，按标准曲线的测定方法测定吸光度后，计算得样品的总黄酮含量。

1.3.2 芦丁标准曲线制作

精密称取于105℃条件下干燥至质量恒定的芦丁标准品10mg，用体积分数为70%的乙醇溶液溶解，定容至100mL，摇匀，得到0.1mg/mL的芦丁标准溶液，备用。分别准确吸取芦丁标准溶液0.00、2.50、5.00、7.50、10.00、12.50、15.00mL于25mL的容量瓶中。先加入5%亚硝酸钠1.00mL，摇匀，放置6min；再加入10%硝酸铝溶液1.00mL，摇匀，放置6min；最后加入1.0mol/L 氢氧化钠溶液5.00mL，用体积分数为70%的乙醇溶液定容至刻度，摇匀，放置10min。用空白液作参比，用分光光度计测定510nm处的吸光度。所得标准曲线为芦丁浓度C和吸光度A的关系，根据所得数据，得到线性回归方程为：A=8.0286×C-0.0006，R2=0.9948。

得率/%

式中：C为测量液总黄酮质量浓度/(mg/mL)；V为粗提液体积/mL；N为稀释倍数；m为原料质量/g。

1.3.4 单因素试验

以乙醇溶液为提取溶剂，固定乙醇溶液体积分数70%、提取温度70℃、料液比1:60、提取时间90min，分别考察不同体积分数的乙醇溶液、提取温度、料液比和提取时间进行单因素试验，按照制作标准曲线的方法测定总黄酮，计算得率，研究不同因素对芦蒿叶总黄酮得率的影响。

1.3.5 响应曲面优化试验设计

表1 响应面试验因素与水平设计Table1 Coded values and corresponding actual values of the optimization parameters used in response surface analysis

1.3.6 数据统计与分析

利用SAS 8.0对数据进行处理和分析，并采用Design-Expert 7.0 软件对响应面试验得到的数据进行线性回归和方差分析，通过F值考察(P＜0.05)模型及因素的显著性。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 乙醇溶液体积分数对芦蒿叶总黄酮得率的影响

图1 乙醇溶液体积分数对芦蒿叶总黄酮得率的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction yield of total flavonoids

如图1所示，芦蒿叶总黄酮得率随乙醇溶液体积分数的增大而提高，当乙醇溶液体积分数达到70%时得率达到最大值，此后随着乙醇溶液体积分数的增大得率开始降低，这可能是由于乙醇溶液体积分数过大，溶液沸点开始降低(乙醇沸点79℃)，导致挥发性过大，同时一些醇溶性的其他物质大量溶出，从而导致黄酮类物质得率降低。因此，最佳乙醇溶液体积分数为70%。

2.1.2 提取温度对芦蒿叶总黄酮得率的影响

图2 提取温度对芦蒿叶总黄酮得率的影响Fig.2 Effect of temperature on the extraction yield of total flavonoidsres

如图2所示，芦蒿叶总黄酮得率随提取温度的升高迅速提高，当温度达到70℃时，总黄酮得率达到最大值，此后随着温度的增加总黄酮得率开始下降，这可能是由于起初总黄酮物质随着温度的升高不断溶出，后来由于温度过高，总黄酮物质受到一定程度的破坏，从而得率下降。因此，最佳提取温度为70℃。

2.1.3 料液比对芦蒿叶总黄酮得率的影响

图3 料液比对芦蒿叶总黄酮得率的影响Fig.3 Effect of solid-to-liquid ratio on the extraction yield of total flavonoids

如图3所示，芦蒿叶总黄酮得率随着料液比的增大而迅速提高，当料液比大于1:80时总黄酮得率提高趋势开始减缓。这可能是由于溶剂量过大时，完全提取总黄酮所需要的时间较长，导致提取不完全。因此，考虑到实际情况节约成本，最佳料液比选为1:80。

2.1.4 提取时间对芦蒿叶总黄酮得率的影响

图4 提取时间对芦蒿叶总黄酮得率的影响Fig.4 Effect of time on the extraction yield of total flavonoids

如图4所示，随着提取时间的延长，芦蒿叶总黄酮得率迅速提高，当提取时间超过150min时总黄酮得率有所下降。这可能是由于长时间高温处理导致乙醇溶液体积分数减小，从而导致总黄酮得率下降。因此，最佳提取时间为150min。

2.2 响应曲面优化试验

2.2.1 二次响应面回归模型的建立与分析

响应面试验设计与结果见表2。应用Design Expert进行多元回归拟合分析，可得到提取条件与总黄酮得率之间的二次多项式模型为：Y=5.54-0.027X1＋0.073X2＋ 0.073X3＋0.11X4-0.23X1X2＋0.29X1X3＋0.25X1X4＋0.43X2X3-0.035X2X4＋0.15X3X4-0.0069 X12＋0.063X22＋0.099X32＋0.47X42。

由表3可知，回归模型具有高度的显著性(P＜0.0001)，失拟项具有不显著性(P=0.8308＞0.05)，R2=0.9909，R2Adj=0.9819，X2、X3、X4均达到极显著水平(P＜0.001)，表明此模型对试验拟合度好，可以对总黄酮得率进行很好的分析和预测。由表3还可以看出，因素X1X2、X1X3、对芦蒿叶总黄酮得率有极其显著的影响(P＜0.01)；因素X1、X2X4、X12对芦蒿叶总黄酮得率影响不显著(P＞0.05)。

表2 响应面试验设计与结果Table2 Experimental design and results for response surface analysis

表3 响应面二次模型的方差分析Table3 ANOVA for the fitted regression model

由F值可知，各因素对芦蒿叶总黄酮得率的影响主次顺序依次为提取时间＞乙醇溶液体积分数＞料液比＞提取温度。

2.2.2 两因素间的交互作用分析

图5 各两因素交互作用对芦蒿叶总黄酮得率影响的响应面图Fig.5 Response surface plots for the effects of operating parameters on the extraction yield of total flavonoids

由图5a可知，当乙醇溶液体积分数一定时，随着提取温度的升高，总黄酮得率不断提高；当提取温度在70～75℃范围时，随着乙醇溶液体积分数的增大，总黄酮得率随之提高。当提取温度在75～80℃范围时，随着乙醇溶液体积分数的增大，总黄酮得率先降低后提高。

由图5b可知，当料液比在1:95～1:100范围时，随着提取温度的升高，总黄酮得率不断减小；当料液比在1:95～1:105范围时，随着提取温度的升高，总黄酮得率不断提高；当提取温度在70～75℃时，随着料液比的增大，总黄酮得率不断降低；当提取温度在75～80℃时，随着料液比的增大，总黄酮得率不断提高。

由图5c可知，当提取时间一定时，随着提取温度的升高，总黄酮得率不断降低；当提取温度一定时，随着提取时间的延长，总黄酮得率先降低后提高。

由图5d可知，当料液比在1:95～1:100范围时，随着乙醇溶液体积分数的增加，总黄酮得率降低；当料液比在1:100～1:105范围时，随着乙醇溶液体积分数的增大，总黄酮得率随之提高；当乙醇溶液体积分数在65%～70%范围时，随着料液比的增大，总黄酮得率降低；当乙醇溶液体积分数在70%～75%范围时，随着料液比的增大，总黄酮得率随之提高。

由图5e可知，当提取时间一定时，随着乙醇溶液体积分数的增大，总黄酮得率随之提高；当乙醇溶液体积分数一定时，随着提取时间的延长，总黄酮得率先降低后提高。

由图5f可知，当提取时间一定时，随着料液比的增大，总黄酮得率不断提高；当料液比一定时，随着提取时间的延长，总黄酮得率先降低后提高。

2.2.3 最佳工艺条件的预测和检验

通过二次多项回归的预测，得到有机溶剂回流提取芦蒿叶总黄酮的最佳条件为乙醇溶液体积分数71.11%、提取温度78.63℃、料液比1:104.14(g/mL)、提取时间178.63min。在此条件下，芦蒿叶总黄酮得率预测值为6.70%。考虑实际操作过程的方便性，将提取工艺参数修正为乙醇溶液体积分数70%、提取温度80℃、提取时间180min、料液比1:100(g/mL)，实际测定的总黄酮得率为6.58%。因此，建立的模型与实际情况基本吻合。

3 结 论

采用有机溶剂回流提取芦蒿叶中总黄酮，通过单因素试验和响应曲面分析优化提取芦蒿叶总黄酮的最佳工艺条件为乙醇溶液体积分数70%、提取温度80℃、料液比1:100(g/mL)、提取时间180min，在以上最佳条件下实际测定的总黄酮得率可达到6.58%。同时得到芦蒿叶总黄酮得率与各提取条件的二次多项式模型，该模型拟合度较好，在实际应用过程中具有一定的实验参考价值。

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Optimization of Extraction Process for Total Flavonoids from Artemisia selengensis Turcz Leaves by Response Surface Methodology

FU Qing-quan1，HOU Pei2，CHEN Neng1
(1. School of Biochemical and Environmental Engineering, Nanjing Xiaozhuang University, Nanjing 211171, China；2. College of Life Sciences, Sichuan University, Chengdu 610064, China)

The extraction of total flavonoids from Artemisia selengensis Turcz leaves was optimized by response surface methodology. The effects of temperature, ethanol concentration, solid-to-liquid ratio and extraction time on the extraction yield of total flavonoids were investigated. A quadratic regression model equation that describes the extraction process was fitted. The results showed that the fitted regression model had high statistical significance and good prediction capability. Four extraction parameters were ranked in descending order of their effect on the extraction yield of total flavonoids as follows: time ＞ ethanol concentration ＞ solid-to-liquid ratio (g/mL) ＞ temperature. The optimal conditions for ethanol reflux extraction of total flavonoids were found to be 70% ethanol, 80 ℃, a solid-to-liquid ratio of 1:100 (g/mL) and 180 min. Under the optimized conditions, the extraction yield of total flavonoids was 6.58%.

Artemisia selengensis Turcz；total flavonoids；extraction process；response surface methodology

TS201.1

A

1002-6630(2013)04-0094-05

2012-05-14

南京晓庄学院校级应用型研究课题项目(2011NXY06)

扶庆权(1975—)，男，工程师，博士研究生，研究方向为生物活性物质及食品添加剂应用。E-mail：fuqingquan@126.com