彭 燕程 也张斯文

1.长春大学校医院医技科，吉林 长春 130115；2.吉林大学白求恩医学院，吉林 长春 130012

维生素C和维生素E联合应用对大鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用

彭 燕1程 也2张斯文2

1.长春大学校医院医技科，吉林 长春 130115；2.吉林大学白求恩医学院，吉林 长春 130012

目的：观察维生素C（VitC）和维生素E（VitE）以及VitC和VitE联合应用对大鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用。方法：采用夹闭肾蒂1h进行并再通进行缺血再灌注损伤的造模，再灌注前10min在不同分组的大鼠进行舌下静脉注入Vit（200mg/kg）；VitE乳剂（100mg/kg）以及Vit（200mg/kg）和VitC联合使用。再灌注2h后测定肾组织匀浆MDA含量及SOD活性，血肌酐，尿素等指标从而观察缺血再关注损伤程度及药物保护作用。结果：VitC给药组、VitE给药组以及VitC、E联合给药组的肾组织匀浆SOD活性明显高于模型组，其中以VitC、E联合给药组最为显著（p＜0.01）；MDA，血肌酐，血尿素值均低于模型组（p＜0.05），以VitC、E联合给药组改善最为显著（p＜0.01）。VitC、E联合给药组与VitE给药组和VitC给药组相比也有显著差异（p＜0.05）。结论：VitC和VitE对肾缺血再灌注损伤具有协同保护作用。

维生素C；维生素E；缺血再灌注损伤

肾缺血再灌注损伤（Ischemia/Reperfusion Injury，/RI）是临床上常见的病理生理现象，肾脏的移植是产生肾脏缺血再灌注损伤的主要情形。其中自由基损伤和脂质过氧化是缺血再灌注损伤的主要机制［1］。对于肾脏缺血再灌注损伤的保护药物近年来也在不断的研究与开发之中，Nakagawa［2］和Cicalese［3］等证实了利用超氧化物歧化酶（SOD）和还原性谷胱甘肽的抗自由基及脂质过氧化作用。但是由于SOD的来源受限以及价格比较昂贵，谷胱甘肽的作用发生需要阿尔法硫辛酸的存在下放能发挥作用。

因此我们可以考虑同样具有抗氧化作用且方便而且价格便宜对人体副作用比较小的维生素C和维生素E作为缺血再灌注损伤的保护药。

研究显示，再灌注前经脉注射VitC和（或）VitE乳剂可有效保护大鼠肺的缺血再灌注损伤，表现在组织损伤程度降低，肌酐尿素氮升高水平得到控制［3］。但是VitC和VitE对肾脏缺血再灌注损伤的保护效果以及联合运用效果和与其它阳性药物效果的比较目前缺少报道。因此我们用大鼠复制了肾缺血再灌注模型，进行VitC和VitE乳剂以及联合用药对缺血再灌注保护作用的研究，通过检测血肌酐、尿素氮、SOD和MDA等指标对动物缺血再灌注损伤程度进行检测。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组 雄性SD大鼠120只（健康状况良好），体重232±10.8g，购自吉林大学实验动物中心。平均分为6组，每组20只。1组为假手术组 （开腹不接扎肾蒂），给予生理盐水注射0.5ml；2－6组进行缺血再灌注造模处理（结扎肾动脉60min）：其中2组每只给谷胱甘肽2mg/kg，加生理盐水至0.5m l；3组每只给维生素C 200mg/kg，加生理盐水至0.5m l；4组每只给维生素E 100mg/kg，加生理盐水至0.5m l；5组为维生素C、E联合给药，每只给维生素C 200mg/kg、维生素E 100mg/kg，加生理盐水至0.5m l；6组为模型组，给予生理盐水每只0.5ml。

1.2 主要药品与试剂 VitC；购自长春亚泰药业集团（批号：20090803）；VitE；购自长春亚泰药业集团（批号：20090815）；还原性谷胱甘肽：购自重庆药友制药有限责任公司（批号：20100321）；MDA试剂盒：购自长春生物制

品所（批号：20090923）；尿素氮试剂盒：购自长春生物制品所（批号：20090925）；肌酐（Cr）试剂盒：购自长春生物制品所（批号：20090809）；超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒：购自长春生物制品所（批号：20090703）。

1.3 复制缺血再灌注损伤模型 3%的戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉，将大鼠仰卧固定于手术台上。腹腔注射20%乌拉坦0.5ml/100g，麻醉彻底后，大鼠按仰卧位固定，经腹腔入路。从大鼠腹侧正中剑突下方向下开一约5cm的口，将肠管翻至体外，找到两侧肾脏后，用结扎线结扎肾蒂，结扎线系活结，结扎完毕后将肠管还纳，用止血钳将切口钳住。皮下注射少量生理盐水。结扎时间为60min，再灌注前10min进行舌下静脉给药。手术结束后，切口周围用青霉素消毒，之后进行缝合。给药2小时后，准备进行相关指标的检测。之后打开腹腔。分离暴露腹主动脉，用注射器直接穿刺动脉采血5ml用于血浆中MDA，肌酐（Cr）和尿素氮 （BUN）的检测。之后继续抽血，处死动物。同时分离左肾，取肾上极组织0.5g，用4.5m l生理盐水在4℃下用电动匀浆机以12000r/min研磨制成10%肾组织匀浆。

1.4 指标测定 严格按照试剂盒说明书操作，测定肾组织MDA含量，SOD含量，血肌酐含量，学尿素氮含量，肾组织形态学观察，取肾下极组织，置于4%甲醛中固定，常规石蜡包埋，切片，HE染色观察。

1.5 统计学处理 采用SPSS15.0软件进行统计学处理，实验所得数据用 （±s）表示，组间进行t检验，计数资料比较用χ2检验。

2 结果

2.1 MDA的测量值 MDA吸光度的测量结果见表1，计算后的MDA值见表2。

经计算后的MDA值在假手术组最低，并且在模型组最高。统计学检测T检验表明：经维生素C和维生素E处理后的动物的MDA值低于模型组（六组）P＜0.05；经维生素C和维生素E处理后MDA值低于维生素C组和维生素E组，P＜0.05。

2.2 血肌酐的测量值 血肌酐测量值见表3，经计算后的MDA值在假手术组最低，并且在模型组最高。统计学检测T检验表明：经维生素C和维生素E处理后的动物的MDA值低于模型组（六组）P＜0.05；经维生素C和维生素E处理后MDA值低于维生素C组和维生素E组，P＜0.05。

2.3 血尿素的测量值 血尿素的测量值见表4：计算后的MDA值在假手术组最低，并且在模型组最高。统计学检测T检验表明：经维生素C和维生素E处理后的动物的MDA值低于模型组（六组）P＜0.05。

2.4 各组大鼠肾组织HE染色病理改变 光镜下可见假手术组肾小球、肾小管结构完整，肾间质未见明显异常。模型组大量肾小管上皮细胞肿胀、坏死，部分肾小管管腔扩张，腔内可见蛋白性液体、红细胞或细胞碎片，肾间质高度充血、炎细胞浸润明显。

其余3个治疗组肾组织病变与缺血再灌注组比较均有所减轻，仅见少部分肾小管管腔扩张，偶见管型，肾间质炎细胞浸润不明显。上述各组均未见肾小球明显病理改变。

3 讨论

由于缺血再灌注损伤主要机制为自由基损伤和脂质过氧化等等。因此，缺血再灌注损伤的治疗和实验研究方面多围绕这两个方面展开［4］。SOD活力的高低间接反映机体清除自由基的能力，而MDA的量常常可反映机体内脂质过氧化的程度，间接地反映出细胞损伤的程度。血肌酐和尿素氮是反应肾损伤的敏感指标，可间接反应肾脏受缺血再灌注损伤的程度。

3.1 维生素C及维生素E对缺血再灌注损伤的保护作用实验结果表明：在给予维生素C和维生素E的处理后，SOD，MDA，肌酐和血尿素的数值有了显著的改善，表明它们具有显著的抗氧化作用。结果与梁应平［5］和蔡虹静［6］等研究结果基本一致。

由于维生素C具有重要的抗氧化性，它还能防止脂质过氧化，促进维生素E循环再生，清除体内自由基和活性氧物质，防止癌症的发生和恶化。维生素C的多项生理功能都与其抗氧化性有关。作为一种天然的水溶性抗氧化剂，它能直接清除生理代谢过程中产生的过量自由基，使机体免受损害［7］。维生素E是O－2的直接清除剂，与超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物一起构成体内抗氧化系统，保护细胞膜及细胞内的核酸免受自由基的攻击。报道［8］维生素E能保护LDL免遭氧化损伤，可有效拮抗氧化型低密度脂蛋白刺激Ca2＋摄入的作用，而LDL可能正是血管氧化损伤的主要成分。

3.2 维生素C与维生素E联合应用对缺血再灌注损伤的保护作用 通过MDA值的计算（表2），在VitCE联合用药处理组（5组）的MDA值显著低于模型组（6组）；并且5组与3组和4组也有显著的差异（P＜0.05），表明维生素CE联合应用后对缺血再灌注损伤的保护作用要明显好于直接应用维生素C或维生素E。

同时血尿素和血肌酐的测定结果表明 （表3，表4）：VitC和VitE联合应用后与维生素C或维生素E单独使用相比具有更好的缺血再灌注损伤的保护作用。

其中VitE单独使用对肾脏缺血再灌注损伤的保护作用较低（SOD值较低，MDA，肌酐，尿素氮值较高），这可能与VitE－自由基还原成VitE，有助于/VitE的再生0，从而发挥协同抗氧化功能［9］。

而维生素CE联合应用的协同抗缺血再关注的机制尚不清晰。可能与以下机制有关：

第一：维生素C和维生素E都是抗氧化剂，均具有抗自由基损伤和纸质过氧化的功能，起协同作用。同时由于VitC为水溶性，VitE为脂溶性，他们的联合应用产生协同效果［10］；第二：由于维生素E的存在也能防止维生素C的氧化，保证在体内的生理功能，如维生素E能直接接受自由基的氧化，从而预防和消除Fe2＋和Cu2＋所引起的维生素C的不良反应。同时，VC具有重要的抗氧化性，当VitE（生育酚）与自由基起反应后，即转变为生育酚羟基自由基，此化合物可被维生素C重新还原为生育酚，重新发挥其抗氧化作用［11］；第三：预先

给予VitC对组织中脂质过氧化物（LPO）的生成有一定的抑制作用，且VitC和VitE联合应用的抑制效果更好［10］，同时也增加超氧化物歧化酶活性。

4 讨论

目前关于缺血再灌注损伤的保护药主要以超氧化物歧化酶 （SOD）、还原型谷胱甘肽、亚硝酸纳等药物为主。但是它们在使用上都有一定的局限性，SOD的价格以及还原型谷胱甘肽的易氧化性使得它们的临床应用还具有一定的弊端。亚硝酸钠通过NO对缺血再灌注起到保护作用同样面临易被氧化，此外，亚硝酸盐类物质的毒性不可忽略。VitC和VitE的联合使用使它们的治疗效果大大提升，以至基本接近亚硝酸钠的水平，并且它们的来源方便，对人体没有危害较小，同时，VitC和VitE具有的美白和滋润肌肤等功效也会使它们的功能复合化和多元化，因此会在临床上预防和治疗缺血再灌注损伤有着很好的应用前景。但是，考虑到VitC和VitE的溶解性存在一定的差异，在复方制药上会有一定的难度，同时，VitC和VitE的相互作用机制还需要深层次的探讨以及联合用药缺少临床的实际观察，因此，VitC和VitE联合应用于缺血再灌注损伤还需要进一步的研究与验证。

表1 吸光度的测定值（×10－2）

表2 MDA计算值（nmol/ml）

表3 血尿素的测定（mmol/L）

表4 血肌酐测定（×10－1mg/dL）

表6 肾组织匀浆SOD值的测定（U/mgprot）

［1］石旦.肾缺血再灌注损伤及其保护的研究进展［J］.医学综述，2009，15（18）：2802－2805.

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［5］梁应平胡衍辉周志东等.维生素C对糖尿病大鼠肾缺血－再灌注损伤的影响［J］.临床麻醉学杂志，2011，27（5）：504－506.

［6］蔡虹静苏庆国徐芳等.黄芪注射液和维生素E联合使用对大鼠肾缺血再灌注损伤的影响.中医杂志，2011，52（7）：1496－1499.

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［11］朱长林，张文彬，孙鹏等.维生素C与维生素E的联合免疫调节及抗氧化作用［J］.中国临床康复，10（36）：120－122.

Effect of vitamin C and vitamin E combination on the protection of renal ischemia reperfusion injury in rats

Yan Peng1，Ye Cheng2，Siwen Zhang2
1.Changchun University Hospital，Medical department；2.Norman Bethune Medical School of Jilin University.

Purpose：to observe the protective effect and mechanism of Vitamin C，Vitamin E and both Vitamin C and Vitamin E on renal ischemia reperfusion injury in rats.Method：We clamped the renal pedicle to make the model and injected vitamin C（200mg/kg），vitamin E emulsion（100mg/kg），and both vitamin C and vitamin E from the sublingual vein at the time of 10 minutes before reperfusion.2 hours after reperfusion the amount of MDA and the activity of SOD in the renal tissue homogenate and creatinine and urea in the blood were measured to observe the degree of the ischemia reperfusion injury.Results：the activity of SOD was enhanced in vitamin C group，vitamin E group and vitamin C combine E group compared to the model group（p＜0.05）especially in vitamin C combine E group（p＜0.01）.The amount of MDA，creatinine and urea was also decreased vitamin C group，vitamin E group and vitamin C combine E group especially in vitamin C combine E group（p＜0.01）.Besides，the activity of SOD was enhanced vitamin C combine E group compared to vitamin C group and vitamin E group（p＜0.05），the amount of MDA，creatinine and urea were decreased in vitamin C combine E group obviously compared to vitamin C group and vitamin E group.Conclusion：vitamin C and vitamin E have a have a protective effect of the ischemia reperfusion injury and combination of both is better in result.

vitamin C；vitamin E；ischemia reperfusion injury.

R151.2

A

1007－8517（2013）10－0023－03

2013.03.26）