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(青岛大学医学院附属医院,山东 青岛 266003 1 医学美容中心； 2 中心实验室)

皮片移植是整形和重建手术的一种重要方法。因受多种因素如受皮区止血、皮片下积液引流、皮片固定等影响，以及对术者技术要求较高，难免发生皮片部分或完全坏死的并发症，因此，提高移植皮片的成活率具有重要的临床意义。已有研究结果显示，脂肪干细胞(ADSCs)干预可以促进缺血组织内新血管的生成，从而提高其成活率；局部应用ADSCs可以提高皮瓣的成活能力[1-2]，但对于ADSCs能否提高移植皮片成活能力尚不明确。本实验通过检测人ADSCs直接分化为血管内皮细胞及其影响血管内皮生长因子(VEGF)表达的能力，探讨人ADSCs对大鼠带真皮下血管网皮片移植成活的影响，为临床应用提供理论基础和实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

原代ADSCs取自山东省人类脐带间充质干细胞库，于我院中心实验室细胞室传代培养。6～8周龄SPF级Wistar雄性大鼠20只，体质量250～300 g，购自山东鲁抗公司，实验期间饲养于SPF级动物实验室。

1.2 实验方法

1.2.1ADSCs培养及鉴定 将细胞培养于含体积分数0.10胎牛血清的DMEM完全培养液中，置于37 ℃、含体积分数0.05 CO2培养箱中，每2～3 d或待培养液颜色偏黄时进行换液。当细胞融合度达90%左右时，用2.5 g/L胰蛋白酶消化分离贴壁细胞，按照1∶2比例传代。每日于光学显微镜下观察细胞形态及生长情况。取生长融合至90%的P3代ADSCs，用2.5 g/L胰酶消化离心，PBS清洗2次，调整细胞密度为1.5×109/L。取200 μL细胞悬液置于1.5 mL的EP管中，样品管中加入CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105流式抗体，对照管中加入同型IgG阴性对照，4 ℃避光孵育30 min，流式细胞仪检测。

1.2.25-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷(EdU)标记ADSCs 将P4代ADSCs以1∶2比例传代，2 d后换10 μmol/L 的EdU培养液孵育24 h。细胞融合达90%时进行消化收集P5代细胞，PBS洗涤细胞，调整细胞密度至1×109/L。在96孔板上同样方法培养EdU标记的样本干细胞，参照EdU试剂盒说明处理样本细胞，倒置荧光显微镜下观察ADSCs的EdU标记情况。

1.2.3大鼠背部全层皮片移植模型建立 Wistar大鼠20只，随机分为两组，各10只。水合氯醛腹腔注射麻醉，背部除毛，参照ZOGRAFOU等[3]方法于大鼠背部中线设计3 cm×3 cm术区，切取带真皮下血管网皮片，实验组皮片筋膜层注射密度1×109/L EdU标记ADSCs悬液0.5 mL，注射点平均分为10点，每点0.05 mL；对照组同样方法注射0.5 mL PBS。皮片原位植回术区，连续锁边缝合，使用抗生素与碘附浸湿的纱布打包固定。所有手术由同一术者相同方法实施，保证移植皮片均匀适当受压。术后大鼠单笼饲养，预防性应用抗生素3 d。

1.2.4移植皮片成活率及组织学观察 术后7 d，过量水合氯醛腹腔注射处死大鼠，根据外观、质地、颜色及针刺出血情况判断移植皮片成活情况。植皮区拍照，应用Image Pro Plus软件分析皮片成活面积，根据公式：皮片成活率=(皮片成活面积/皮片设计面积)×100%，计算皮片的成活率。将移植皮片取下，多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，连续5 μm纵向切片，苏木精-伊红(HE)染色，光镜下观察皮片组织中坏死、炎症细胞浸润及新生血管形成情况。免疫组织化学染色检测皮片组织中血管内皮系细胞特异性标志物CD31及血管内皮生长因子(VEGF)的表达：随机选取40个高倍视野(200倍)，采用双盲法测定每个视野内的血管数量，计算微血管密度；每例标本选取10个视野(200倍)，Image Pro Plus软件分析VEGF表达。

1.2.5ADSCs在移植皮片内分布及分化检测 取未染色连续切片，参照EdU试剂盒说明书检测组织EdU阳性细胞表达，倒置荧光显微镜观察ADSCs在组织中的分布情况，综合HE染色与CD31免疫组化染色结果分析ADSCs在组织中的分化。

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 ADSCs的体外培养形态学及表面标志物鉴定

ADSCs细胞体外贴壁生长，单核，形态呈成纤维细胞样、长梭形、旋涡状整齐排列，传代培养细胞形态稳定。流式细胞仪检测显示，ADSCs表面标志物CD44、CD73、CD90、CD105表达阳性，造血细胞系标记物CD34、CD45表达阴性。

2.2 EdU标记干细胞检测

倒置荧光显微镜下观察，视野内ADSCs全部核染，呈红色荧光，细胞质未染荧光，细胞呈梭形，EdU成功标记于ADSCs。

2.3 移植皮片大体观察及成活率

术后7 d,移植皮片的成活区域与坏死区域界限清晰，成活的皮片呈现粉白色、柔软、纹理正常；坏死的皮片呈黑色或褐色，针刺不出血，去除表层痂皮后见化脓灶。实验组大鼠移植皮片成活率为(95.51±5.79)%，对照组为(70.04±10.79)%，两组比较，差异有统计学意义(t=6.575，P<0.05)。

2.4 HE染色

HE染色光镜下观察，实验组皮片成活区可见大量新生血管，主要集中在真皮下层，尤其是新生肉膜区，炎症浸润区域小；对照组皮片成活区新生毛细血管数量较少，大量炎性细胞浸润真皮层及肌层。

2.5 免疫组织化学染色

实验组大鼠移植皮片组织单位面积(每200倍视野)内微血管数目为(10.55±4.43)个，对照组为(5.85±3.13)个，两组比较差异有显著性(t=3.870，P<0.05)。VEGF免疫组化阳性表达为棕色，实验组VEGF广泛表达，为新生的毛细血管；对照组表达不明显。实验组VEGF的表达水平为130.31±8.71，对照组为54.22±13.82，两组比较差异有显著性(t=14.729，P<0.05)。

2.6 EdU标记ADSCs荧光检测

倒置荧光显微镜下观察，EdU阳性表达呈红色高亮状态，EdU阳性细胞构成血管样结构；经对照CD31免疫组织化学染色结果，证实EdU阳性细胞构成新生血管内皮，EdU标记的ADSCs在受体内直接分化为血管内皮细胞，参与构建毛细血管。

3 讨 论

皮片移植是整形和重建手术中频繁使用的重要方法,如创面覆盖、先天性缺陷整复、慢性创面修复等。因皮片成活受多种因素影响，其成活率在临床手术中约为70%～100%。移植皮片发生部分或完全坏死难以避免，这给医患双方带来无法弥补的痛苦，因此，提高移植皮片的成活率具有重要的临床意义。移植皮片的成活关键在于与受皮区基底形成良好的血供，而新血管形成是构建移植皮片与受皮区基底血供的关键。

自从ZUK等[4]成功分离ADSCs后，ADSCs以其具有多向分化潜能、来源充足、易于体外分离培养、抗原性低等优点越来越受到人们的关注。对于ADSCs的鉴定，目前没有专一特异性的表面标记物，所以需要进行多项表型测定来确定。ADSCs源于中胚层，与骨髓间充质干细胞(BMSCs)表面标志物有90%是一致的，CD73、CD29、CD44、CD105等表达阳性，CD34、CD44、CD45、HLA2DR等表达阴性。本文鉴定结果与近年对干细胞的研究相符[5-8]。已有研究表明，ADSCs可以通过扩展原有的毛细血管网及分化为血管内皮细胞形成新生血管[1-2,9]，同时有研究称ADSCs可以促进组织生长因子表达，从而促进血管生成和创面愈合[10-14]。利用ADSCs的这两个作用提高缺血组织成活能力成为一种新的治疗手段。

本实验探讨局部移植ADSCs能否促进大鼠带真皮下血管网皮片移植成活及其机制。对移植皮片成活情况观察及组织学研究结果表明，局部移植人ADSCs可以明显提高大鼠移植皮片的成活率及成活能力；术后7 d，实验组皮片成活面积、颜色、质地等成活情况指标明显优于对照组；将皮片组织取下，肉眼观察实验组肉膜层内细小血管明显多于对照组，这在皮片组织HE染色观察及CD31免疫组化染色结果对比中也得到了证实。提示较高的血管密度是提高皮片成活能力的关键。

EdU体外标记ADSCs的检测结果表明，EdU能成功标记于ADSCs细胞核。由于EdU标记于细胞核中，可以随着ADSCs的增殖分化在组织内持续表达，因此，检测组织内EdU阳性表达可以准确反映ADSCs在组织内的分化与分布。本文研究结果显示，ADSCs在移植皮片组织内呈单层血管内皮细胞形态，形成管腔样结构，与CD31免疫组化结果综合分析，ADSCs可以在组织内分化为血管内皮细胞。这表明至少一部分ADSCs直接参与构建新生毛细血管，与文献报道结果一致[4，8]。

研究结果还表明，ADSCs可以促进组织分泌血管生成因子,如VEGF。VEGF对微血管发生、血管生成均有直接的促进作用[1]。本文免疫组化结果表明，实验组VEGF表达明显高于对照组，说明移植到皮片组织的ADSCs可以通过促进皮片组织内VEGF表达，进一步促进新血管的生成。

研究表明，传代以后的人ADSCs表面组织相容性抗原表达减少，并且在与异体基因外周血单核细胞共同培养时不会引起T细胞的细胞毒作用[15]。本实验中，大鼠在实验期间没有发生明显的不良反应，移植细胞成功在大鼠组织内分化，说明传代后人ADSCs具有低免疫原性。

综上所述,局部移植人ADSCs可以促进大鼠带真皮下血管网皮片移植的成活，该作用是通过促进组织分泌VEGF及ADSCs在组织内参与构建新生血管实现的。深入研究ADSCs对皮片移植成活促进作用的具体机制及准确的应用方法，会对自体皮片移植及异体皮片移植产生深远影响，为临床应用提供理论依据及方法。

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