qPCR和电泳对siRNA转染效率鉴定分析

2013-01-24冯军军

中国医药指南 2013年3期

关键词：电泳脂质体阳离子

冯军军

（山西大医院检验科，山西太原 030030）

qPCR和电泳对siRNA转染效率鉴定分析

冯军军

（山西大医院检验科，山西太原 030030）

RNA 干扰（RNAi）技术是近些年快速发展并被越来越多人逐渐越发重视的一项基于转录水平上的基因阻断技术，具有序列特异性、时效性、高效性和易操作性等诸多优点，而研究结果证实，siRNA 即小分子干扰 RNA 是 RNAi最主要的作用因子。本文分别介绍了qPCR 和电泳两种对 siRNA 转染效率的鉴定方法，以供参考。

qPCR；电泳；siRNA 转染效率；鉴定

据统计，最有效的siRNA 抑制靶基因表达效率超过90%，好的鉴定方法甚至可将表达效率提升至99%，如此对于基因治疗而言，siRNA可作为基因组功能研究的有力工具，而且脂质体在所有已用于临床试验的基因载体中仅次于病毒载体，是最有发展前景的非病毒载体[1-3]。为此，本文分别介绍了qPCR和电泳两种对siRNA转染效率准确、方便、高校的鉴定方法，具体如下。

1 qPCR法

siRNA是定量检测是RNAi抗病毒效果的关键，而当前RNAi作为特异抗病毒治疗的热点，因此为检测抗CSFV特异siRNA分子，即siN1和siN2在细胞中的表达水平，必须构建筛选具有高特异性和灵敏度的siRNA特异茎环引物，而RT-qPCR及为siRNA的最优检测方法，其可较好地表现出特异性和灵敏度，可检测出101-108个复制的siRNA，检测范围亦达到7个数量级之多，而且其平行性较好（RSQ=0.999），扩增效率也较高达到了98.3%。具体操作方法如下。

1.1 RNA提取

将抗CSFV的PK-15 细胞克隆，并培养在6孔细胞培养皿中，待其满度达到90%-95%之间时，可将培养液弃掉，改用1mL PBS在冰上将细胞清洗两次，然后根据说明书的要求加入500μL的裂解液，在提取其总的RNA，并将PK-15细胞作为阴性对照。同时，再用NanoDrop1000测量RNA的质量和浓度，并将它们装在-80℃的环境下保存。

1.2 逆转录反应

逆转录反应包括50 mmol/L茎环引物，0.25 mmol/LdNTPs，3.33 U/μL逆转录酶，0.25U/μL RNA酶抑制剂，等倍的逆转录缓冲液，10mg总RNA，用无RNA酶水补至15μL。其反应的条件即冰上搁置5mins，15℃温度下30mins，43℃下同样30mins，直至85℃酶灭活5mins，最后搁置4℃将其保存。

1.3 实时定量PCR反应

该体系为10μLPCR预混液，1.5μmol/L上游引物0.7μmol/L通用下游引物，0.2μmol/L MGB探针，1.2μLcDNA 产物，去离子水补至20μL。再在实时定量PCR仪上进行反应，条件为95℃下变性15s，热启动10mins，再转成60℃退火60s，收集荧光，反复循环40次。需注意的是，所有阴性细胞对照和空白对照都须充分两遍，再去均值。

1.4 灵敏度和特异性分析

根据RT-qPCR检测绘制标准曲线，计算细胞表达的siRNA 拷贝数，并分析此方法检测灵敏度。在将与siRNA大小相似的内源性miRNA作为特异性分析材料，选择PK-N1、PK-N2 和PK-siC 细胞克隆和阴性细胞PK-15和PFF的总RNA胃模板进行siRNA的RT-qPCR检测，进而评价检测的特异性。

2 电泳法

2.1 配置荧光染料

将SYBR Gold荧光染料用TBE缓冲液稀释10000倍，取5μmol/ LsiRNA 溶液，吸取0；2；4；5；8；10μL分别注入聚乙烯离心管中，同时相应地加入19；18；16；15；2；10μL的缓冲液，待充分融合后制成相应的siRNA标准溶液，再在各管中加入50%蔗糖-溴酚兰溶液5μL，待进行涡旋离心后将上述溶液分别加入20%聚丙烯酰胺凝胶5μL，然后在100V电压下电泳2小时，待凝胶放入SYBR Gold荧光染料中染色20mins后在凝胶成像系统中观察siRNA 条带并拍照。

2.2 回收率实验

回收率实验可按照以下步骤进行，即①取空白脂质体胶体溶液10μL，并分别加入高、中、低3中不同浓度的siRNA 标准溶液各5μL静置15mins；②加入0.1 mol/LTritonX-100溶液和0.1%肝素溶液各2μL，使siRNA 从阳离子脂质体中完全释放；③加入RNA提取试剂即按照氯仿∶苯酚∶异戊醇=25∶24∶1比值制成的混合溶液25μL，静置15mins后，再在4℃条件下离心20mins；④收集含有siRNA的水相部分，加入上样缓冲液6μL，待充分混合后再取5μL混合物加入凝胶加样孔中，根据凝胶电泳的程序观察siRNA；⑤根据标准曲线方程算出siRNA的浓度，进而计算回收率。

2.3 精密度实验

根据“标准曲线的绘制”项进行操作，在5日内测定高、中、低3 种浓度的siRNA含量，并计算其精密度，对此亦可以进行阳离子脂质体中siRNA 的含量测定，即精密量取载基因阳离子脂质体胶体溶液10μL，再按上述操作方法，求出siRNA的浓度值。

2.4 载基因阳离子脂质体包封率测定

siRNA会有两部分，一部分被阳离子脂质体包裹，存在凝胶孔中，另一部分处于游离状态，而这部分游离的siRNA经过电泳后会在凝胶中形成条带，即致使siRNA和载基因脂质体分离。再精密量取载基因阳离子脂质体胶体溶液15μL，再加入上样缓冲液5μL，将二者充分混合，再取混合溶液5μL加入到凝胶孔中，待电泳过程完备后，观察游离部分的siRNA条带情况，同时按照标准曲线计算游离siRNA浓度C1，再精密量取载基因阳离子脂质体胶体溶液10μL，根据含量测定相应方法计算阳离子脂质中的siRNA总浓度C，如此即可得到包封率（被包裹物质（如某药物）在脂质体悬液中占药物总量的百分量）=（C-C1）/C × 100%。

3 两种方法对siRNA转染效率的鉴定结果

3.1 电泳法鉴定结果

通过对脂质中 siRNA含量的测量，检测其线性范围为0.2～2.0μmol/L，其中R=0.9931，另高中低三种溶液浓度分别为96.36%，96.93%和100.75%，其中n=3，另5日内和日间的精密度RSD均＜5%，符合方法学要求。

3.2 qPCR法鉴定结果

通过qPCR法对siRNA转染效率的鉴定结果表明，高、中、低3 种浓度的回收率在95.1%～101.2%之间，且RSD的精密度均＜2.0%，符合方法学要求。

4 讨论

4.1 电泳法

计算机技术的快速发展和应用使得对电泳图谱的分析更加科学化和精确化，比如ImageJ即是一种可对图像面积、重心、平均密度以及多边形区域进行分析的图像分析程序，它可以自动对图像进行点的分析、以及测定路径长度和角度等诸多功能。实践证明，采用ImageJ分析电泳图谱灵敏度较高、重复效果好，剂量-密度/亮度的线性关系明显，而且操作简单、取样量少、分析快速精确等诸多优点，因此可有效提高工作人员的工作效率。

4.2 qPCR法

本文所阐述的RT-qPCR法，可较准确的定量检测细胞抗病毒siRNA 的表达水平，例如在抗猪瘟病毒转基因动物的构建中，它可有效提高你抗病毒转基因动物的成功率，并未将来转基因动物的抗病毒效果评价提供有力参考，不仅如此，此法对siRNA 、miRNA等小RNA的检测工作亦具有很好的参考价值。