周冬琴，莫海波，芦治国，於朝广，徐和宝，殷云龙

〔江苏省·中国科学院植物研究所（南京中山植物园），江苏 南京 210014〕

墨西哥落羽杉（Taxodium mucronatum Tenore）为杉科（Taxodiaceae）落羽杉属（Taxodium Rich.）植物。20世纪70年代，同属植物落羽杉〔T.distichum（L.） Rich.〕和池杉（T.ascendens Brongn.）大量应用于中国水网地区的绿化，随即墨西哥落羽杉的应用也逐渐引起人们的重视。20世纪60年代叶培忠教授开展了墨西哥落羽杉（♀）与柳杉（♂）的杂交育种研究［1-2］；20世纪70年代开始，江苏省·中国科学院植物研究所针对中国东部沿海滩涂面积广和树种资源缺乏的实际情况，开展了落羽杉属树种速生、耐湿、耐盐碱品种的选育以及落羽杉（♀）与墨西哥落羽杉（♂）种间杂交等工作，并培育出‘中山杉302’和‘中山杉118’等新品种［3］，几十年的品比试验、中间示范试验和江浙皖多点区域试验均表明这些杂种无性系具有观赏价值高、速生、耐湿、耐盐碱、抗风力强、病虫害少、材质优良和适应性广等特点［4-7］。为了进一步丰富墨西哥落羽杉种质资源，从2003年开始作者所在的研究小组先后从美国引进墨西哥落羽杉种源3批，并筛选出17个墨西哥落羽杉优良单株。

杂交育种是通过不同个体间杂交创造变异和选育新品种的方法。杂交育种的物质基础是种质差异，只有杂交亲本间具有较多、较大的个体差异，才能创造出更多的变异。因此，育种材料遗传多样性的分析对于杂交育种亲本选择有着重要的理论指导意义。分子标记技术的发展为植物遗传多样性分析提供了可靠的技术手段，目前杉木遗传育种研究工作中常用的分子标记有RAPD［8-10］、RFLP［11］和 ISSR［12-13］等，但都存在一些不足，如：RAPD标记的重复性和稳定性较差，检测位点不多；RFLP方法费时、费力，需要进行DNA多种酶切、转膜以及探针的制备等多个步骤，且仅能够对基因组单拷贝序列进行鉴定；ISSR分析方法在PCR扩增时需要一定时间摸索最适反应条件并且呈显性遗传标记，不能区分显性纯合基因型和杂合基因型。

SRAP（sequence-related amplified polymorphism，相关序列扩增多态性）标记是21世纪初诞生的新型DNA分子标记，由美国加州大学 Li和 Quiros开发［14］。该方法利用独特的引物设计方法对编码基因的开放阅读框（ORF）区域进行设计，其多态性因个体间内含子有无、大小及启动子与间隔长度不等而异，较AFLP和RAPD等标记更能反映表型的多样性及进化史。Ferriol等［15］利用11对SRAP引物组合分析了47份南瓜〔Cucurbita moschata（Duch.ex Lam.） Duch.ex Poiret〕种质，多态性达66.2％；Budak等［16］利用SRAP分析了53种野牛草〔Buchloe dactyloides（Nutt.）Engelm.〕的遗传多样性，多态性高达95％。於朝广等［17］利用48对SRAP引物对亲本落羽杉与墨西哥落羽杉进行多态性分析，筛选出29对多态性引物，其中的1对引物可对落羽杉与墨西哥落羽杉的4个杂交后代进行杂种真实性鉴定。因而，利用SRAP标记可有效检测种质资源的遗传多样性。

本研究旨在利用SRAP标记对墨西哥落羽杉优良单株的遗传多样性进行评价，为落羽杉属杂交育种工作中优良亲本的选择提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

供试18个单株均为墨西哥落羽杉的优良单株。1～8号单株选自2003年引自美国加州的种源（原产墨西哥），于2004年分别种植于南京中山植物园实验苗圃和浙江宁波永丰园林绿化建设有限公司苗圃，其中1～6号单株选自浙江群体，7～8号单株选自南京中山植物园群体；9～17号单株选自2005年由美国奥斯汀州立大学提供的种源（原产美国新墨西哥州），于2006年播种于南京中山植物园实验苗圃；18号单株来源于南京中山植物园繁殖圃内的墨西哥落羽杉大树，为南京本地产墨西哥落羽杉（来源于南京东南大学校园内）的扦插后代。

参照文献［18］的方法确定优良单株。通过简单的目测比较确定10棵候选树，以候选树为中心，划定面积15 m×15 m的样方10个，随机测量样方十字线上30棵树的株高、胸径和冠幅并计算平均值和标准差，当候选树的指标位于该基本群体相应指标平均值加0.5个标准差以上时则为优良单株。

1.2 方法

1.2.1 总DNA提取及检测 取新鲜嫩叶3～5 g置于液氮中快速研磨，采用CTAB法［19］提取总DNA并检测其质量和浓度，然后溶解于TE缓冲液中，贮藏于-20℃冰箱中备用。

1.2.2 SRAP引物筛选、扩增条件及扩增产物检测参考Li等［14］发表的引物序列筛选SRAP引物，引物合成由上海英骏生物技术有限公司完成。选取15条正向引物和5条反向引物（表1）组合成45对引物，从中筛选出7对扩增条带清晰、多态性丰富的引物组合对18个优良单株总DNA进行PCR扩增。

表1 用于墨西哥落羽杉优良单株总DNA SRAP标记分析的引物序列Table1 Primer sequences used for SRAP marker analysis of total DNA from superior individuals of Taxodium mucronatum Tenore

采用Mastercycler ep PCR仪（德国Eppendorf公司）进行扩增反应。反应体系总体积10μL，包括20 ng模板DNA、1×PCR缓冲液、2.0 mmol·L-1Mg2+、0.2 mmol·L-1d NTPs、0.2 mmol·L-1引物和0.5 U Taq DNA聚合酶。反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，35℃退火1 min，72℃延伸2 min，5个循环；94℃变性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸2 min，30个循环；72℃补齐5 min。扩增产物于4℃保存备用。

扩增产物在DYY-8B型电泳仪（江苏南达生物技术开发公司）上采用质量体积分数10％聚丙烯酰胺凝胶进行电泳检测，电压240 V，电泳时间2 h。电泳结束后参照文献［20］采用快速银染法显色：先用含体积分数10％乙醇和体积分数0.5％冰乙酸的混合溶液固定12 min，用质量体积分数0.2％AgNO3溶液银染12 min，水洗后用含质量体积分数1.5％ NaOH、体积分数0.4％甲醛和质量体积分数0.02％ Na2S2O3的混合溶液显色5～10 min至谱带清晰，自来水冲洗后在Tanon-2500全自动数码凝胶图像分析系统（上海天能科技有限公司）中观察并拍照。

1.3 数据处理

根据相同迁移率条带的有无进行统计，有条带的记为“1”、无条带的记为“0”，形成条带的二元数据矩阵。在假定种群处于Hardy-Weinberg平衡状态下，采用POPGENE v1.32软件计算多态性条带数、Nei’s基因多样性指数、Shannon信息指数和遗传相似系数等；采用UPGMA分子系统聚类法由MEGA3.1软件生成聚类图。

2 结果和分析

2.1 SRAP扩增结果分析

选用18号优良单株对所有引物组合进行初筛，有30对引物组合有清晰的扩增条带；再用1号、3号、9号、12号和15号单株对初筛的30对引物组合进行复筛，筛选出19对具有清晰条带的引物组合；然后采用这19对引物组合对18个优良单株进行扩增，筛选出7对反应稳定、重复性好的引物组合（表2）用于18个优良单株的SRAP分析。

表2 用于墨西哥落羽杉优良单株SRAP分析的引物组合及扩增结果Table2 Primer combinations used for SRAP analysis of superior individuals of Taxodium mucronatum Tenore and amplification result

墨西哥落羽杉18个优良单株的SRAP扩增结果见表2。由表2可见：7对引物组合共扩增出87条带，多态性条带71条，多态性条带百分率为81.6％。其中用引物组合Me09+Em10扩增出的条带数和多态性条带数均最多，分别达21和17条；用引物组合Me08+Em07、Me19+Em08和Me18+Em08扩增出的条带数最少，均只有9条；用引物组合Me18+Em08扩增出的多态性条带数最少，仅6条。引物组合Me08+ Em07和Me19+Em08扩增出的多态性条带百分率则达100.0％；引物组合Me18+Em08扩增出的多态性条带百分率最低，仅66.7％。

2.2 墨西哥落羽杉优良单株的遗传差异分析

根据引种地和种植地将18个墨西哥落羽杉优良单株分为4组并采用SRAP标记进行遗传多样性分析，结果见表3。9～17号优良单株的多态性条带百分率（PPB）、观察有效等位基因数（na）、有效等位基因数（ne）、Nei’s基因多样性指数（H）和Shannon信息指数（I）最高，分别为64.4％、1.644、1.369、0.214和0.322；1～6号优良单株的PPB、na、ne、H和I值居中，分别为52.9％、1.529、1.287、0.171和0.260；7号和8号2个优良单株的PPB、na、ne、H和I值均最低，分别为25.3％、1.253、1.179、0.105和0.153；18号单株单独成组，无法计算其PPB、na、ne、H和I值。18个优良单株总体的PPB、na、ne、H和I值分别为81.6％、1.816、1.376、0.229和0.355。

表3 基于SRAP标记的18个墨西哥落羽杉优良单株的遗传多样性分析结果1）Table3 Analysis result of genetic diversity of eighteen superior individuals of Taxodium mucronatum Tenore based on SRAP marker1）

对4组18个优良单株的遗传分化分析结果显示：基因分化系数为0.4799，即有47.99％的遗传变异存在于群体间；种水平的基因多样性为0.235；组内的基因多样性为0.122；基因流为0.542，表明各组间的基因交流比较少。

2.3 墨西哥落羽杉优良单株的聚类分析

墨西哥落羽杉18个优良单株间的遗传相似系数和遗传距离见表4。18个优良单株间的遗传相似系数为0.6322～0.9195，平均值为0.7539。其中，3号和9号单株的遗传相似度最大，遗传相似系数为0.9195；5号和18号以及7号和10号单株间的遗传相似系数均最小，为0.6322，而18号单株与另外17个单株的遗传相似系数均较低，遗传差异较大。

根据18个优良单株的遗传相似系数，采用UPGMA法进行聚类分析，结果见图1。由图1可见：在遗传相似系数0.70处可以把18个单株分为3组：18号和14号单株分别单独成组；其余的16个单株共同聚为1组。在遗传相似系数0.80处又可把16个单株进一步分为8个亚组：1号、7号、12号和15号单株各自单独成亚组，2号、3号、5号、9号、11号和13号单株聚为1个亚组，4号和6号单株、8号和17号单株、10号和16号单株各自聚为1个亚组。

表4 墨西哥落羽杉18个优良单株间的遗传相似系数和遗传距离1）Table4 Genetic sim ilarity coefficient and genetic distance among eighteen superior individuals of Taxodium mucronatum Tenore1）

续表4 Table4（Continued）

3 讨论和结论

由于落羽杉属树种具有干型直、材质好、耐盐碱和耐水湿等优良特点，自引入中国以来一直倍受林学界的关注。为培育满足国内生态环境建设需求的树种，江苏省·中国科学院植物研究所持续进行了落羽杉属种间杂交的研究工作［21-23］，培育出‘中山杉302’、‘中山杉401’、‘中山杉405’、‘中山杉406’和‘中山杉407’等新品种［3，24］。随着落羽杉属杂交育种工作的进一步深入，需要不断丰富杂交亲本的遗传多样性，为此作者所在研究中心先后从美国引进墨西哥落羽杉种源3批。为了明确现有墨西哥落羽杉的遗传多样性状况，作者通过基因组总DNA的SRAP标记对18个墨西哥落羽杉优良单株进行了遗传分析，结果显示：18个墨西哥落羽杉优良单株的Nei’s基因多样性指数为0.229，Shannon信息指数为0.355，遗传相似系数为0.6322～0.9195，与周玉珍等［10］利用RAPD标记对53个墨西哥落羽杉优良无性系进行的遗传分析结果类似。说明引种可以有效丰富国内现有墨西哥落羽杉种质资源的遗传多样性。

在供试的18个优良单株中，18号单株为目前国内树龄最大的1株墨西哥落羽杉的无性系后代，存在生理年龄老化的问题。聚类分析结果表明：目前新筛选出的优良单株（1～17号优良单株）与18号优良单株间的遗传差异较大，这为选配新的杂交组合、培育优良品种及创造优良变异类型奠定了遗传基础。

根据聚类分析结果可将18个单株分为3组8亚组，每个亚组中的单株遗传关系均较近，因此在选配杂交组合时可以选择遗传关系较远的单株，以避免杂交亲本单一等问题，从而在有限的土地资源和人力资源条件下创造更多的优良杂交组合。

18个优良单株的聚类分析结果与其引种地和种植地的相关性不明显，这可能与本研究中优良单株的选择和引物的选择有关。本实验筛选出的引物组合数较少，对研究结果有一定的影响，因此，应进一步扩大引物筛选的范围，对墨西哥落羽杉亲本和杂交墨西哥落羽杉进行更为精确的遗传分析。

图1 18个墨西哥落羽杉优良单株的UPGMA聚类图Fig.1 UPGMA cluster dendrogram of eighteen superior individuals of Taxodium mucronatum Tenore

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