吴 硕，傅建敏，乌云塔娜，梁玉琴

柿属EST-SSR引物设计及遗传多样性研究

吴 硕1，傅建敏1，乌云塔娜2，梁玉琴1

(1.中国林业科学研究院 经济林研究开发中心，河南 郑州 450003；2.中南林业科技大学 经济林育种与栽培国家林业局重点实验室，湖南 长沙 410004)

利用从NCBI上下载的9 474条EST(Expressed Sequence Tags)序列，设计并开发EST-SSR引物，用于柿属种质资源的遗传多样性研究。下载的初始序列拼接成1 390条重叠序列和4 097条无重复序列。用SSRHunter软件搜索到601条EST序列中含有540个SSR。SSR出现频率为10.96%，其中以2核苷酸为主。依据检出的SSR-ESTs序列设计SSR引物100对，对9个柿属(Diospyros L.)种质资源样品进行了PCR扩增，其中42对引物有扩增带，占设计引物的42%，其中30对引物有多态性，占可扩增引物的71.4%。同时发现引物15是美洲柿(雄)的特异引物；引物30是青化北野柿的特异标记；引物69和引物80为美洲柿的特异引物；引物99是无核软枣的特异引物。

柿属；EST；SSR标记；遗传多样性

柿科柿属Diospyros L.植物为我国重要的经济林资源。其中的柿D.kaki、油柿D.oleifera、君迁子D.lotus[1]等果实及其成分广泛用于食品、饮料[2]、制药[3]、工业[4]等多种行业，具有良好的生态效益和经济效益。中国柿属植物在长期生长进化过程中，由于遗传变异和自然人工选择的作用，分化出了许多宝贵的可利用新资源[5]，但对这些宝贵资源的研究，特别是针对各种用途的新品种的选育研究相对滞后。因此利用先进的SSR(Simple senquence repeat，简单序列重复)分子育种技术将大大促进柿属资源新品种的创育效率。但截止至2010年底，国内柿属SSR引物极度缺乏[6]，急需开发柿属SSR标记。

随着近年来cDNA文库的建立，开发了大量的EST序列。快速增长的ESTs数据为SSR标记的开发带来了新的契机，已成为了SSR标记的重要来源。EST-SSR技术是近年来最为常用的SSR引物设计方法，在百合[7]、高丹草[8]、核桃[9]和铁皮石斛[10]等多个物种中均成功设计出SSR引物，且操作简便、引物特异性较高，且具有较高的信息量，通用性好。因此本研究应用NCBI上现有的EST数据开发柿属的引物，辅助柿属育种及遗传多样性研究。

1 材料与方法

1.1 试验材料

9个柿属植物种质资源，分别为湖南乌柿D.cathayensis，浙江野柿D.kaki，青化北野柿D.kaki，青化南野柿D.kaki，浙江柿D.glaucifolia，美洲柿(雌)D.virginiana(female)，美洲柿(雄)D.virginiana(male)，云南野毛柿D.artrotricha，无核软枣D.lotus。其中美洲柿(雌)和美洲柿(雄)同属美洲柿种；浙江野柿、青化北野柿和青化南野柿同为野柿；无核软枣属于君迁子种。

1.2 引物设计

利用GenBank等数据库中查找并下载柿属的EST序列[11]，然后用EST-trimmer去除含末端存在的polyA、polyT的“尾巴”结构的序列和用seqclean来屏蔽载体序列。再应用vector NTI软件进行做EST序列的聚类和拼接[12]，以获得无冗余EST和尽可能长的重叠序列(contig)。应用SSRHunter软件[13]查找含SSR的EST序列，查找的标准为2、3、4、5和6核苷酸重复基元的重复次数分别大于或等于7、5、4、3和3次[14]。应用Primer Premier 5.0[15]和Oligo设计引物，引物长度为18～22 bp，GC%为40%～60% ，扩增产物预期片段为100～350 bp。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.3 实验方法

1.3.1 DNA提取

采用CTAB法[16]提取DNA。选择不同植株的适宜叶片，剪碎后液氮研磨，取100 mg粉末置于1.5 mL离心管中，加入800 μL抽提缓冲液和50 μL巯基乙醇，充分混匀后，65 ℃水浴保温1 h。冷却至室温，在4 ℃低温离心12 000 r/min，15 min。然后取上清液加入70 μL 5M NaCl，充分摇匀，静置5 min。再加入700 μL三氯甲烷混合液(三氯甲烷∶异戊醇=24∶1)再次剧烈振荡混匀后离心，12 000 r/min，12 min 。取上清液重复加入三氯甲烷混合液2～3次至无白色杂质产生。再取上清液加入700 μL异戊醇缓慢颠倒至无生白色絮状沉淀，静置5～10 min，然后10 000 r/min离心6 min。弃上清液留沉淀，用75%乙醇清洗2遍，每次离心9 000 r/min，6 min。留沉淀，倒置风干至无水珠。再加入 500 μL 1M NaCl，2 μL 10 ng/mL RNA酶，37 ℃水浴1 h。再加入1 000 μL无水乙醇，-20 ℃沉淀2 h。然后1 000 r/min离心6 min，弃上清液，用75%乙醇1 000 μL清洗沉淀，1 000 r/min离心6 min，用无水乙醇清洗沉淀，同样1 000 r/min离心6 min弃上清液，倒置风干至无水珠。最后加入200 μL TE溶解DNA，-20 ℃保存。DNA用1.5%琼脂糖电泳检测并定量。

1.3.2 PCR扩增和电泳检测

在前期实验中我们通过正交试验对柿属的SSR反应条件和反应参数进行了优化。最终确定总反应体积为 25 μL，模板 DNA 2 μL，2×Taq PCR MasterMix(天根生化科技有限公司)8 μL，10 mmol/L引物(金斯瑞生物公司)各1 μL，加ddH2O至25 μL。PCR扩增仪型号为S10000(联想生物科技有限公司)。参数为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，51 ℃复性1 min，72 ℃延伸2 min，循环35次，最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。扩增完毕，以1.5%的琼脂糖凝胶电泳分离，对有扩增产物的样品再用8%PAGE(聚丙烯酰胺)电泳分离，用紫外照相机(Bio-Rad公司)照相并记录结果。

2 结果与分析

2.1 柿属植物SSR引物开发设计

2.1.1 EST数据的取得与前处理

从NCBI等数据库下载柿属植物的EST序列9 474条。初始EST序列中首先去除小于150 bp的低质量片段，再用EST-trimmer去除含末端存在的polyA、polyT的“尾巴”结构的序列317条；用seqclean来屏蔽载体序列，获得柿属植物EST序列9 157条。

2.1.2 EST数据的聚类和拼接

应用vector NTI软件进行做EST序列的聚类和拼接后，获得5 487条有效的EST序列，其中包括1 390条重叠序列contig，为25.3%，4 097条无重复single序列，为74.7%。

2.1.3 EST中SSR序列的发掘与分析

应用SSRHunter软件，从5 487条EST序列查找SSR序列，查找的标准为2、3、4、5和6核苷酸重复基元的重复次数分别大于或等于7、5、4、3和3次。结果表明，5 487条EST序列中找出601条序列含SSR，SSR检出率达10.95%。其中二核苷酸重复组合有12种共367条，占61%，二次重复最多的是CT组合，有123条；三核苷酸重复组合有60种共196条，占33%，最多为CTT组合，有15条；四核苷酸重复组合有31种共38条，占6%，最多为CATA组合，为3条(表1 )。可见SSR主要属于二、三核苷酸重复类型，且不同重复基元出现与否及其频率高低有明显的偏倚性。也与柿属现有的EST数较少、覆盖度不足。

2.1.4 EST-SSR引物设计

应用Primer5.0和Oligo引物设计软件，按照引物设计标准，对601条EST序列设计引物。结果表明共设计出155对合格的SSR引物。从中选取较好的100对引物进行合成，对9个柿属植物种质资源进行多态性筛选。结果42对引物有扩增条带，其中11对扩增出非目的条带，30对扩增出稳定清晰的目的条带且有多态性，1对引物有目的条带但无多态性。

表1 含SSR序列中重复基元种类数目Table 1 Repeated types and numbers of SSR sequences

2.2 遗传多样性分析

用筛选出的30对引物(表2)对柿属的9个种质资源样本进行扩增，共获得143扩增带，其中142为多态性条带，多态性比例达99.3%，片段长度在100～350 bp之间，平均每对引物约5条带；其中P15、P30、P69、P78、P80、P89和P99共7对引物均扩增出单一条带(约占0.7%)。

通过实验得到5对特异性引物，分别为P15是美洲柿(雄)的特异引物，P30是青化北野柿的特异引物，P80和P69为美洲柿的特异引物，P99只能扩增出无核软枣(图1)。

表2 引物序列Table 2 Information of primer pairs

续表2Continued table 2

柿属9个样品聚类后分为6类，见图2。其中浙江柿明显与其他柿属品种亲缘关系较远，表明浙江柿这个种较为特殊，起源较为奇特，很有研究价值。浙江柿、浙江野柿和青化北野柿3个种与其余6种亲缘关系较远。野毛柿、无核软枣、美洲柿和乌柿间亲缘关系较近。除美洲柿两个品种外，乌柿和青化南野柿亲缘关系较近，起源相近。而青化北野柿和青化南野柿虽名字相近，但亲缘关系较远，可能分属不同的种。美洲柿的雌雄品种同为美洲柿种下的两个品种，亲缘关系较其他种要近。图中可见其虽有有微小差别，但亲缘关系极近，表明此些引物用于鉴定品种间亲缘关系准确可靠。

3 讨 论

近年来，公共数据库中EST数量的剧增，为SSR标记的开发提供了一条快速而有效的途径。柿属在NCBI上共有9 474条EST序列，相较于其他种属来说数据量较少。下载的EST拼接为5 487条序列，共查找出601条含SSR序列，SSR检出率达11.9%。高于水稻的4.7%[17]，而低于茶树的15.48%[18]。表明不同的物种和不同的搜索条件会产生不同的结果。同时也表明初始数据量的多少与SSR的检出率无关。

查询出的柿属SSR主要属于二、三核苷酸重复类型，高阶核苷酸组合极少，表明不同重复基元出现与否及其频率高低有明显的偏倚性。如果EST数足够大且无偏倚性，则4种不同的碱基随机组合将产生单核苷酸2种、二核苷酸4种、三核苷酸10种，四核苷酸33种，五核苷酸102种和六核苷酸350种基本重复类型[19]。而本实验中的重复种类明显少于理论值，这或许与柿属现有EST数较少、覆盖度不足有关。

筛选出来的30对引物的扩增位置主要处于CDS区域，仅有3对引物来源于5'UTR，表明SSR序列存在于基因的不同部位表现出差异性，或许还表明位于CDS的引物相较5’UTP和3’UTP更易产生扩增，均表现了引物的选择有其偏好性。

通过对9个柿属种质资源的聚类分析，发现浙江柿与其余8个样品亲缘关系较远，可能有不同的起源。同时结果表明美洲柿雌雄品种间亲缘关系最近，符合事实情况，表明实验结果真实可靠。本试验确定了柿属常见种的亲缘关系，这对于加速柿属EST资源的开发利用、丰富其分子标记类型、遗传资源评价、绘制遗传图谱和实现特定性状的辅助选择等研究都具有重要的意义。

图1 特异性引物标记Fig.1 Special makers

图2 9个柿属种质资源样品聚类分析Fig.2 Dendrogram of 9 germplasm resources of Diospyros L.

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Study on EST-SSR primer design and genetic deversity of Diospyros L.

WU Shuo1, FU Jian-min1, WUYUN Ta-na2, LIANG Yu-qin1
(1.Non-timber Forest Research and Development,Center of Chinese Academy of Forestry, Zhengzhou 450003, Henan, China;2.The Key Lab of Non-wood Forest Product of Forestry Ministry, Central South University of Forestry & Technology, Changsha 410004, Hunan, China)

The 9 474 ESTs of Diospyros L.in the database of NCBI were downloaded, then were used to design EST-SSR makers.The obtained makers were used to analyze diversity of 9 germplasm resources (Diospyros L.).The 9 474 ESTs after some redundants and some low qualities were removed, finally assembled into 1 390 contigs and 4 097 singles.Then by using SSRHunter software, 540 SSRs in 601 ESTs were found, accounting for 10.96% of ESTs, and most of them were dinucleotides.One hundred primer pairs were designed for polymorphism analysis in 9 genotypes(Diospyros L.).Forty two primer pairs showed the amplification, accounting for 42% of designed primers, and 30 primer pairs showed polymorphisms, accounting for 71.4% of primers available.Meanwhile, P15 was special primer of D.virginiana(male), P30 was special primer of north Qinhua-D.spp., P69 and P80 were special primers of D.virginiana, P99 were special primers of D.lotus.

Diospyros L.; EST; SSR maker; genetic diversity

S718.46

A

1673-923X(2012)03-0152-06

2012-01-06

国家林业公益性行业科研专项(200904041)

吴 硕(1985—),女,河北石家庄人,硕士研究生,研究方向为经济林遗传育种;E-mail：snow-shuoer@163.com

傅建敏(1963—),女,河南禹州人,副研究员,主要从事经济林育种与栽培的研究;E-mail：fjm371@163.com

[本文编校：吴 毅]