陈晓玲，丁 菲，赵一入，江昌俊

（安徽农业大学茶叶生物化学与生物技术教育部重点实验室，合肥230036）

体细胞胚发生作为20世纪后期植物组织培养中的一个重大发现和突破，与植物另一种再生方式即器官分化相比，具有数量多、速度快、结构完整、再生率高等优点[1]，在很多领域被广泛应用，如作为稳定、高效的植物再生体系[2]和理想的遗传转化受体体系[3]。植物体胚发生的方式分直接和间接两种：不通过愈伤组织阶段直接从外植体表面或内部细胞产生体细胞胚的方式叫体胚的直接发生。先诱导出愈伤组织（直接诱导胚性愈伤，或由非胚性愈伤再转化成胚性愈伤），体胚由胚性愈伤组织分化产生的方式叫做体胚的间接发生[4]。目前，在茶树的组织培养中，对于体细胞胚发生的过程和不同阶段的形态特征没有详细的报道。本文探究了茶树体细胞胚的发生方式，描述了以茶树子叶为外植体诱导体细胞胚发生的各个阶段的形态学特征，并进行了相关细胞学分析，以期为茶树离体再生和遗传转化的研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

舒茶早 [C.sinensiscv.shuchazao]10月中旬的种子，采自安徽农业大学农业园。

1.2 培养基及培养条件

培养基P：MS+0.2 mg·L-1NAA+2.0 mg·L-16-BA+1.0mg·L-1GA3；蔗糖 30 g·L-1，琼脂 0.75%，pH 5.8。白炽灯光照强度 50μmol·m-2·s-1，12h 光照，25±2℃培养。

1.3 体细胞胚的诱导

将采集的种子去除果皮，表面消毒，无菌操作下剥去种皮，将子叶切割成0.5cm2，分为带胚子叶和不带胚子叶两种处理，接种于体细胞胚诱导培养基P中，30d为一周期，继代培养。观察体细胞胚的形成过程。

1.4 体细胞胚的细胞学观察

取供显微观察的体细胞胚材料，固定于FAA中，常规石蜡切片，切片厚10μm，番红与固绿染色，显微镜下观察、摄影。

2 结果与分析

2.1 体细胞胚产生的两种方式

子叶在体细胞胚诱导的过程中，通过两种方式产生体细胞胚。一种是直接产生体细胞胚：带胚子叶接种到培养基中，初代内胚萌发出胚芽胚根，随后在子叶柄处直接产生体细胞胚，分化出芽丛（图1-A）。直接产生体细胞胚历时很短，从接种2代内即可发生并萌发。另一种是间接产生体细胞胚：子叶不带胚部分在继代培养中体积膨大，逐渐转化成胚性愈伤组织，然后分化出体细胞胚（图1-B）。通过间接方式产生体细胞胚时间较长，不同胚性愈伤组织的个体差异较大，继代4～7代时，体细胞胚陆续发生。带胚子叶可以通过直接和间接两种方式产生体细胞胚，不带胚子叶只通过间接方式产生体细胞胚。

图1 体细胞胚产生的两种方式

2.2 体细胞胚间接发生途径各阶段的形态特征

不带胚子叶和带胚子叶的子叶部分以间接方式产生体细胞胚。在诱导的过程中，不同阶段形态特征差异较大。子叶离体培养3周左右，子叶表面产生大量的瘤状突起（图2-A），细胞团不断膨大形成胚性愈伤组织，颜色由淡黄色逐渐变为绿色（图2-B），继代培养颜色继续加深，至墨绿色时，其表面形成半透明颗粒状小突起（图2-C）即为体细胞胚，进一步培养可萌发（图2-D），分化出芽丛（图2-E）。绿色加深是胚性愈伤组织成熟的表现。成熟的胚性愈伤组织在继代中，一方面分化出体细胞胚并萌发出芽，另一方面产生次级胚性愈伤组织增殖（图2-F）。新产生的次级胚性愈伤组织黄绿色、半透明（图2-F），分割培养不会等到完全成熟时再产生下一级胚性愈伤组织，而是成熟与增殖同时进行（图2-G）。次级胚性愈伤组织颜色转变为绿色时即有体细胞胚的分化（图2-H）。

图2 体细胞胚发生各阶段的形态

2.3 体细胞胚的细胞学观察

从形态学上观察，绿色的胚性愈伤组织表面产生半透明的颗粒状小突起继续培养具有分化出芽的能力，即为体细胞胚，于是对其做了进一步的细胞学观察。以图2-C所示组织为材料，石蜡切片（图3）显示，颗粒状突起处细胞小且排列紧密，细胞质浓，有若干个分生区域，说明此处细胞已完成脱分化，具有很强的分化能力。

图3 体细胞胚处若干分生区域

3 讨论

本研究发现茶树体胚发生既可以通过直接方式也可以通过间接方式。2006年Seran等报道茶的体细胞胚直接从成熟胚的胚轴上产生[5]，但本实验中只在子叶柄处发现体细胞胚的分化，胚轴上并未发现。子叶柄处直接分化出体细胞胚，可能与茶树子叶柄本身存在胚性细胞，其表皮层或亚表皮层存在较强的器官发生潜力有关[6]。体细胞胚的间接发生途径中，根据渐变理论[1]，茶树子叶发生隆起是细胞脱分化、分化的标志。

体细胞胚的直接发生途径历时短，不经过愈伤组织阶段，理论上遗传稳定性更强；而间接发生途径产生的体胚数量大，并且通过产生次级胚性愈伤组织继续分化，增殖倍高。胚性愈伤组织特定时期的细胞学观察表明，体细胞胚在胚性愈伤组织上产生，二者不能等同。在组织培养中，可以根据胚性愈伤组织的形态特征，了解其所在的发育时期，以便更好地控制离体再生体系或选择合适时期作为遗传转化的受体。

[1]朱澂.植物组织培养中的胚状体[J].遗传学报,1978,5(1)∶79～88.

[2]Francis Wachira,Ogada,Johoson.In vitro regeneration of Camellia sinensis(L.)O.Kuntze by somatic embryogenesis[J].Plant Cell Reports,1995,14∶463～466.

[3]A.Bhattacharya T.K.Mondal, P.S.Ahuja.Transgenic tea [Camellia sinensis (L.) O.Kuntze cv.Kangra Jat]plants obtained by Agrobacterium-mediated transformation of somatic embryos[J].Plant Cell Reports,2001,20∶712～720.

[4]周秀梅.牡丹体细胞胚胎发生研究[D].北京∶北京林业大学,2008.

[5]Seran Thayamini H,Hirimburegamak,Gunasekare.T.K.Direct somatic embryogenesis from explants obtained from in vitro germinated embryonic axes of Camellia sinensis(L.)O.Kuntze[J].Journal of horticultural science&biotechnology,2006,81(5)∶883～890.

[6]刘德华，周带娣，熊格生.茶树体细胞植株再生的光照效应[J].湖南农业大学学报,1999,25(2)∶112～115.