季润元，史恩溢，王永实，李小宁，赵玉芳，冯振卿

1)淮阴卫生高等职业技术学校;淮安市消化道肿瘤重点实验室 淮安 223300 2)苏州卫生职业技术学院病理教研室 苏州 215009 3)淮安市肿瘤医院病理科淮安 223200 4)南京医科大学病理学系南京 210029

△男，1969年1月生，硕士，副教授，研究方向:肿瘤病理，E-mail:christ7777@163.com

结直肠癌组织中运动相关蛋白1/CD9和ME491/CD63的表达*

季润元1)△，史恩溢2)，王永实1)，李小宁2)，赵玉芳3)，冯振卿4)

1)淮阴卫生高等职业技术学校;淮安市消化道肿瘤重点实验室 淮安 223300 2)苏州卫生职业技术学院病理教研室 苏州 215009 3)淮安市肿瘤医院病理科淮安 223200 4)南京医科大学病理学系南京 210029

△男，1969年1月生，硕士，副教授，研究方向:肿瘤病理，E-mail:christ7777@163.com

结直肠癌;运动相关蛋白1/CD9;ME491/CD63

目的:研究结直肠癌组织中运动相关蛋白1(MRP1)/CD9和ME491/CD63的表达及其临床意义。方法:应用组织芯片的免疫组织化学技术检测239例结直肠癌组织中MRP1/CD9和ME491/CD63的表达。结果:MRP1/ CD9在结直肠癌组织中的表达与肿瘤的分化程度、Dukes分期、淋巴结转移有关(χ2=8.930、7.430和5.857，P均＜0.05)，而与患者的性别、年龄、浸润深度无关(χ2=1.800，0.014和0.096，P均＞0.05)。ME491/CD63的表达与结直肠癌临床病理指标无关。结直肠癌组织中MRP1/CD9和ME491/CD63的表达呈正关联(rP=0.311，P＜0.001)。结论:MRP1/CD9可作为结直肠癌的预后因子。结直肠癌组织中MRP1/CD9和ME491/CD63的表达呈正关联。

跨膜4超家族(transmembrane 4 superfamily，TM4SF)是结构上属于细胞膜糖蛋白的特殊家族，该家族中有5个成员即运动相关蛋白1(mobility related protein-1，MRP1)/CD9、黑色素瘤相关抗原ME491/CD63、KAI1/CD82、CD151和CD81，与细胞的运动、增殖和肿瘤细胞的转移有关［1-2］。MRP1/ CD9的表达水平与肿瘤进展、侵袭和转移密切相关，低表达的恶性肿瘤侵袭能力强，易发生转移［2］。黑色素瘤相关抗原ME491在肿瘤早期进展过程中高度表达。CD63与血小板激活有关，是一种溶酶体糖蛋白，存在于多种类型细胞表面。该研究探讨结直肠癌组织中MRP1/CD9和ME491/CD63的表达情况及其与临床病理参数之间的关系，以期找到结直肠癌新的预后因子［2］。

1 材料与方法

1.1 标本来源 收集江苏省淮安市肿瘤医院2005年1月至2010年12月结直肠癌手术切除标本239例，男123例，女116例;年龄48～72(69.2±2.1)岁。病理分型均为腺癌，其中高分化34例、中分化160例、低分化45例。Dukes分期:A期10例、B期133例、C期73例、D期23例。所有患者均无肠癌家族遗传史，术前均未接受过放化疗。

1.2 组织芯片的构建 所有的肿瘤组织标本均经中性甲醛固定，常规石蜡包埋，4 μm连续切片，HE染色。观察HE切片，确定具有代表性的病变部位后，应用自有专利技术的组织芯片构建仪(专利号200920350099.2)制备组织芯片。用构建仪在选取的组织蜡块中穿取组织，直径1.5 mm。应用自有的组织芯片制备系统(包括组织芯片包埋底模、组织芯片胶、组织芯片阵列模、一次性加取样针及其配套使用的针芯和针帽、定位冷却器以及植芯器等组成部分)依次按序操作，成功制成含有239例结直肠癌的组织芯片蜡块，每个病例均含有2个原发灶肿瘤组织。用德国LEICA石蜡切片机连续切片，厚度为4 μm。

1.3 结直肠癌组织中MRP1/CD9和 ME491/ CD63表达的检测 采用MaxVision两步法，严格按照MaxVision染色试剂盒说明书进行操作。鼠抗人MRP1/CD9和ME491/CD63单克隆抗体购自美国Thermo公司，MaxVision试剂盒、DAB酶底物显色试剂盒等购自福州迈新公司。结直肠癌组织芯片常规脱蜡水化，1 mmol/L EDTA(pH 8.0)水浴修复20 min。而后加MRP1/CD9或ME491/CD63一抗(稀释50倍)，4℃冰箱过夜，第2天室温平衡后，加MaxVision二抗培育30 min，DAB显色，苏木精复染。以PBS代替一抗作阴性对照。以细胞膜和(或)细胞质出现棕褐色颗粒者为MRP1/CD9或ME491/CD63阳性表达细胞。400倍光镜下计数5个视野，阳性细胞＜25%为阴性，≥25%为阳性。

1.4 统计学处理 应用SPSS 13.0分析，不同临床病理特征结直肠癌患者MRP1/CD9和ME491/CD63表达的比较应用χ2检验，MRP1/CD9和 ME491/ CD63表达之间的相关性采用 Pearson列联系数。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 MRP1/CD9和ME491/CD63表达与结直肠癌临床病理特征的关系 见表1。

表1 MRP1/CD9和ME491/CD63表达与结直肠癌临床病理特征的关系 阳性例数(%)

图1 MRP1/CD9(A)和ME491/CD63(B)在结直肠癌中的表达(MaxVision，×400)

2.2 结直肠癌组织中MRP1/CD9和 ME491/ CD63表达情况 见图1。239例结直肠癌组织中MRP1/CD9阳性者188例，阴性者51例;ME491/ CD63阳性者209例，阴性者30例。MRP1/CD9和ME491/CD63在结直肠癌中的表达呈正关联(rP= 0.311，P＜0.001)，见表2。

表2 结直肠癌组织中MRP1/CD9和ME491/CD63表达的关系 例

3 讨论

在TM4SF家族中，MRP1/CD9是研究比较广泛的成员之一。Radford等［3］在体外将MRP1/CD9的cDNA转移至肿瘤细胞中，结果发现转染MRP1/ CD9后肿瘤细胞的运动能力和生长都受到抑制。Powner等［4］也证实转染MRP1/CD9 cDNA后的BL6鼠黑色素瘤细胞的转移潜能比亲代BL6细胞低。以上结果提示，MRP1/CD9能直接调节肿瘤细胞运动并影响细胞的生长。MRP1/CD9抑制肿瘤细胞运动增殖的作用不仅体现在细胞水平研究，而且在胃癌［5］、胃肠道间质肿瘤［6］、口腔鳞状细胞癌［7］、食管癌［8］等许多实体肿瘤的研究中也得到了证实。Hashida等［9］检测146例结直肠癌组织中 MRP1/ CD9的表达水平，发现MRP1/CD9阳性表达的患者总生存率明显高于阴性表达者。该研究结果显示，结直肠癌组织中MRP1/CD9表达与组织分化、淋巴结转移有关，中、高分化和无淋巴结转移组阳性表达率高;同时Dukes分期D期结直肠癌组织中MRP1/ CD9的阳性表达率下降。上述结果提示，MRP1/ CD9蛋白表达与结直肠癌的恶性生物学行为呈负关联，表明MRP1/CD9表达可能成为评估结直肠癌预后的有用指标。

ME491抗原由237个氨基酸组成，有4个跨膜区，3个N-糖基化点［10］。ME491/CD63在黑色素瘤早期阶段高表达，但在正常黑色素细胞中不表达，在黑色素瘤进展阶段和转移性黑色素瘤中低表达或不表达［3］。目前极少数文献认为ME491/CD63的表达和其他肿瘤进展有关［11］。在作者的研究中，亦未能证明ME491/CD63的表达与结直肠癌转移、分级、浸润深度、Dukes分期有关。

有研究［12］报道MRP1/CD9的表达在激活的血小板表面和ME491/CD63相关，但实体肿瘤中未见两者相关的报道［1］。该研究结果显示，结直肠癌组织中MRP1/CD9和ME491/CD63的表达呈正关联。

总之，对MRP1/CD9和ME491/CD63及其与肿瘤相关性的研究，将有助于进一步揭示肿瘤的转移机制，找到抑制肿瘤转移的靶点或预测肿瘤患者预后的指标。

［1］Woegerbauer M，Thurnher D，Houben，et al.Expression of the tetraspanins CD9，CD37，CD63，and CD151 in Merkel cell carcinoma:strong evidence for a posttranscriptional fine-tuning of CD9 gene expression［J］.Mod Pathol，2010，23(5):751

［2］ Chen Z，Gu S，Trojanowicz B，et al.Down-regulation of TM4SF is associated with the metastatic potential of gastric carcinoma TM4SF members in gastric carcinoma［J］.World J Surg Oncol，2011，9:43

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［4］Powner D，Kopp PM，Monkley SJ，et al.Tetraspanin CD9 in cell migration［J］.Biochem Soc Trans，2011，39(2):563

［5］Soyuer S，Soyuer I，Unal D，et al.Prognostic significance of CD9 expression in locally advanced gastric cancer treated with surgery and adjuvant chemoradiotherapy［J］.Pathol Res Pract，2010，206(9):607

［6］Setoguchi T，Kikuchi H，Yamamoto M，et al.Microarray analysis identifies versican and CD9 as potent prognostic markers in gastric gastrointestinal stromal tumors［J］.Cancer Sci，2011，102(4):883

［7］Buim ME，Lourenco SV，Carvalho KC，et al.Downregulation of CD9 protein expression is associated with aggressive behavior of oral squamous cell carcinoma［J］.Oral Oncol，2010，46(3):166

［8］季润元，束晓明，张徐宁，等.食管癌组织KAI1/CD82、MRP1/CD9的表达及其临床意义［J］.江苏医药，2010，36(13):1498

［9］Hashida H，Takabayashi A，Tokuhara T，et al.Clinical significance of transmembrane 4 superfamily in colon cancer［J］.Br J Cancer，2003，89(1):158

［10］Pols MS，Klumperman J.Trafficking and function of the tetraspanin CD63［J］.Exp Cell Res，2009，315(9):1584

［11］Kwon MS，Shin SH，Yim SH et al.CD63 as a biomarker for predicting the clinical outcomes in adenocarcinoma of lung［J］.Lung Cancer，2007，57(1):46

［12］Israels SJ，McMillan-Ward EM，Easton J，et al.CD63 associates with the alphaIIb beta3 integrin-CD9 complex on the surface of activated platelets［J］.Thromb Haemost，2001，85(1):134

Expressions of MRP1/CD9 and ME491/CD63 in colorectal carcinoma tissue

JI Runyuan1)，SHI Enyi2)，WANG Yongshi1)，LI Xiaoning2)，ZHAO Yufang3)，FENG Zhenqing4)1)Huaiyin Advanced Vocational and Technical Hygiene School;Huai’an Key Lab of the Tumor of Digestive System，Huai’an 223300 2)Department of Pathology，Suzhou Health College，Suzhou 215009 3)Department of Pathology，Cancer Hospital of Huai’an City，Huai’an 223200 4)Department of Pathology，Nanjing Medical University，Nanjing 210029

colorectal carcinoma;mobility related protein-1/CD9;ME491/CD63

Aim:To study the expressions of mobility related protein-1(MRP1)/CD9 and ME491/CD63 in colorectal carcinoma tissue.Methods:Tissue microarray and immunohistochemistry were used to detect the expressions of MRP1/CD9 and ME491/CD63 in 239 cases of colorectal carcinoma.The correlations between MRP1/CD9 and ME491/CD63 expression as well as the clinical and pathological characteristics were analyzed.Results:The expression of MRP1/CD9 was closely related with the differentiated degree，Dukes stages，and lymph node metastasis(χ2=8.930，7.430，5.857;P＜0.05).And it had no relationship with the patients’sex，age，or the depth of infiltration(χ2=1.800，0.014，0.096，P＞0.05).No correlation was found between the expression of ME491/CD63 in colorectal carcinoma and its clinicopathological materials.Positive association was found between the expression of MRP1/CD9 and ME491/CD63(rP=0.311，P＜0.001).Conclusion: The expression of MRP1/CD9 is a prognostic factor of colorectal carcinoma.The expression of MRP1/CD9 significantly correlates with the expression of ME491/CD63.

R735.3

10.3969/j.issn.1671-6825.2012.06.011

*江苏省卫生厅医学科技发展基金资助项目 J201116

(2012-05-18收稿 责任编辑李沛寰)