何海燕，张健，覃拥灵，*

（1.河池学院化学与生命科学系，广西 宜州 546300；2.广西卫生职业技术学院，广西 南宁 530021）

植物纤维素是地球上最丰富、最廉价的可再生资源，占植物界碳素50%以上。植物每年通过光合作用，能产生高达15.5×1010t纤维素类物质，其中纤维素、半纤维素的总量为8.5×1010t。纤维素组成叶干重的大约10%，木材的大于50%，麻纤维的70%～80%，棉纤维的90%～98%[1-2]。纤维素可以作为食品、饲料、能源、造纸、纺织、医药、建筑、电工、电子、机械等许多领域都有广泛的应用[3-6]。

纤维素酶系是一组协同作用降解纤维素生成葡萄糖的酶的总称，主要分为三类：葡聚糖外切酶（EC 3.2.1.91）在天然纤维素的降解过程主导作用，从纤维素链的末端水解β-1，4糖苷键，依次切下纤维二糖分子，生成纤维寡聚糖和纤维二糖；β-葡聚糖内切酶（EC 3.2.1.4）可结合在纤维素链内部的非结晶区的任何部位随机水解β-1，4糖苷键，切断纤维素链产生有非还原端的小分子纤维素，主要产物是纤维二糖、纤维三糖和纤维寡聚糖等；β-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.21）将纤维二糖或其他可溶性的纤维寡糖水解成葡萄糖分子，消除纤维二糖和纤维寡糖对葡聚糖内切酶和葡聚糖外切葡酶的反馈抑制作用，在纤维素的降解中起着非常关键的作用[7]，纤维素酶在粮食、饲料、轻工业、能源等方面有广泛运用[8-9]。

本课题前期实验筛选得到一株高产纤维素酶的灰白青霉HML0233[10]，本实验对灰白青霉HML0233进行诱变改良选育及固体发酵产酶研究，以期提高其酶活，为工业化应用提供实验工艺参数。

1 材料与方法

1.1 实验菌种

灰白青霉HML0233是实验室筛选保存菌种[10]。

1.2 培养基

1.2.1 PDA斜面培养基[11]

1.2.2 固体发酵产酶培养基

3g蔗渣，2g麸皮。固体培养基材料均粉碎至100标准目数（筛孔尺寸0.15 mm），加入10 mL Mandels营养盐液，250 mL锥形瓶，121℃灭菌20 min。

Mandels营养盐液[12]：（NH4）2SO41.4 g，KH2PO42 g，CaCl20.3 g，MgSO4·7H2O 3 g，FeSO4·7H2O 5 mg，MnSO41.6 mg，CoCl22.0 mg，ZnCl21.7 mg，自然 pH，定溶于1000 mL蒸馏水中。

种子培养基：0.5%葡萄糖，Mandels营养盐液。

1.3 紫外诱变灰白青霉HML0233

1.3.1 灰白青霉HML0233生长曲线的测定

灰白青霉HML0233斜面种30℃培养4 d复壮，取复壮后菌种接种200 mL种子培养基中，于30℃、160r/min摇床培养，每隔4h取样，分光光度计在600nm下测定光密度，以未接种的培养基作对照。以培养不同时间的种子培养基的光密度为纵坐标，时间为横坐标作图，得到灰白青霉HML0233在种子培养基上的生长曲线[11]。

1.3.2 紫外诱变与与正突变菌种筛选

先将出发菌株接种于种子培养基中摇瓶培养，到达对数生长期后离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤两次，加入无菌生理盐水使孢子数目达107数量级，振荡成为单细胞悬液。

紫外诱变照射时间分别为0～100 s，时间梯度间隔10 s。以未经紫外线照射处理的菌悬液涂布PDA平板，避光培养72 h，作为对照组计算致死率，以UV的照射时间为横坐标，致死率为纵坐标，作致死率曲线[11]。

诱变突变株筛选：以致死率达90%以上的照射时间为诱变剂量处理菌悬液并涂布葡聚糖内切酶活性鉴定平板：羧甲基纤维素钠（CMCNa，Fluka公司）10 g，琼脂20 g，用Mandels营养盐液定容至1000 mL，用高压灭菌锅121℃灭菌20 min后倒平板。把诱变后菌种涂布于葡聚糖内切酶活性鉴定平板，30℃避光培养4 d，印章法转移菌种至同规格PDA培养基中保存菌种，葡聚糖内切酶活性鉴定平板用0.2%刚果红染色20 min，1 mol/L的NaCl脱色，如可分泌葡聚糖内切酶可以水解鉴定平板的CMCNa得到透明圈[13]。

从筛选平板上选取透明圈较大的菌落取菌种一环接种至种子液培养基，30℃，160 r/min培养24 h，使孢子预萌发，取107个孢子（1 mL）种子液接入固体培养基，30℃，培养4 d后测酶活复筛鉴定。

1.3.3 遗传稳定性实验

将筛选到的菌株接种于PDA培养基上传代，参照1.3.2固体发酵方法，每代都在相同的发酵培养条件下培养，共传8代，测定其FPA酶活。

1.4 滤纸酶活测定（Filter paper assay，FPase）

滤纸酶活（FPA）参照Mandels等的方法测定[12]：将1条whatman一号滤纸条[（1×6 cm；（50±1）mg]折叠放入试管底部，加1 mL pH 4.8的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液和0.05 mL适当浓度的酶液混匀，30℃反应60 min；对照管为沸水浴6 min灭活的粗酶液。然后用DNS法测定还原糖的生成量，比对葡萄糖标准曲线计算反应产生的葡萄糖浓度确认酶活。

酶活力单位定义：每秒催化产生1 mol还原糖需要的酶量为1 kat。

1.5 固体发酵产酶条件研究

1.5.1 发酵时间对固体发酵产酶影响及酶液的提取

取107个孢子转入固体发酵产酶培养基中，30℃培养，培养 3 d～6 d 后提取酶液。按 10∶1（mL/g 固体培养基）加入dd H2O，40℃，200 r/min恒温摇床2 h，八层纱布过滤，4℃，5000 r/min离心20 min，上清液即为粗酶液。

1.5.2 不同温度、培养基初始pH、不同氮源对产酶的影响研究

接入107个孢子，30℃～50℃，每隔5℃一个梯度，培养适宜时间后提取酶液；调节培养基初始pH为4～7，考查培养基初始pH对产纤维素酶的影响；选择不同氮源：蛋白胨、NH4Cl、NH4NO3、黄豆饼粉取代Mandels营养盐液的（NH4）2SO4，考查不同氮源对诱变菌种产酶的影响。

酶液4℃冰箱中保存，待测酶活时用。三次平行实验，取平均值。

2 结果与分析

2.1 紫外诱变灰白青霉HML0233

2.1.1 灰白青霉HML0233在种子培养基上的生长曲线

测定灰白青霉HML0233在种子培养基里面的生长情况，所得结果如图1所示。

图1 灰白青霉HML0233的生长曲线Fig.1 The growth curve of Penicillium canescens HML0233

0～36 h为生长延迟期，从40 h开始进入对数生长期，菌体细胞数快速增长，细胞健壮；到48 h～60 h以后进入繁殖率与死亡率逐渐趋向于平衡的稳定期。本试验选择对数生长中后期（48 h～56 h）的菌体进行诱变选育，因为这时细胞活力最强，诱变效果较好。

2.1.2 紫外诱变致死率曲线

随着紫外照射时间的延长，致死率逐渐增大，时间为60 s时，致死率为93%。当时间达到80 s时致死率为100%，如图2所示。

图2 紫外诱变致死曲线Fig.2 The curves of death rate and survival rate after UV mutant

本实验选择60 s的照射时间进行紫外诱变。

2.1.3 紫外诱变结果

以 FPA酶活为 0.88×10-7kat/mL的灰白青霉HML0233为出发菌株，经紫外诱变得到15株突变菌株，编号为HBQ1-HBQ15，间隔接种于葡聚糖内切酶活性鉴定平板，30℃培养3 d，经刚果红染色和NaCl脱色后[13]，葡聚糖内切酶可以水解鉴定平板的CMCNa得到透明圈见图3。

图3 突变菌种在羧甲基纤维素钠筛选平板上产生透明水解圈Fig.3 Mutant strains produced clear hydrolytic zone around theirs colonies on a CMCNa selective agar plate

实验结果表明：透明圈直径：菌体直径数值越大，活力越高，其中HBQ14菌株酶活提高到1.46×10-7kat/mL，提高了66.6%，说明紫外诱变后HBQ14产纤维素酶活有明显提高。利用羧甲基纤维素钠为底物，刚果红染色筛选产纤维素酶菌种，灵敏度高，产生的透明圈清晰，实验证明酶活与透明圈直径：菌体直径成线性关系，刚果红透明圈筛选法可以快速筛选出产纤维素酶的菌株。以HBQ14菌株作为实验菌株，进行遗传稳定性实验。

2.2 紫外诱变遗传稳定性实验

诱变正突变HBQ14菌株的酶活为1.46×10-7kat/mL，8次传代后酶活为1.42×10-7kat/mL，为母代菌株酶活的97.2%，代间酶活差异不大，证明HBQ14经紫外诱变后遗传性状稳定见表1。

表1 HBQ14菌株遗传稳定性试验结果Table 1 The inheritance stability experiments of the strain HBQ14

2.3 温度对产纤维素酶的影响

较高的温度可以提高发酵过程中微生物体内生物化学反应过程，提高催化合成纤维素酶的酶活性，结果见图4。

图4 温度对产纤维素酶的影响Fig.4 The effect of temperature on activity of cellulose

当培养温度为40℃时，酶活比30℃培养温度提高 22%，为 1.78×10-7kat/mL。

2.4 培养基初始pH

对产纤维素酶的影响40℃，不同pH培养4 d。设最适pH最高酶活为100%，测定不同pH相对酶活作图，见图5。

图5 pH对产纤维素酶的影响Fig.5 The effect of pH on activity of cellulase

测定得出蔗渣天然固体培养基pH为6。实验结果显示，pH为5.5时，HBQ14所产的纤维素酶酶活最高，比天然培养基提高12%，达到2.1×10-7kat/mL。培养基pH改变细胞膜所带电荷，从而改变细胞膜的通透性，排出胞外纤维素酶增加，提高整体酶活。

2.5 氮源对产纤维素酶的影响

蛋白胨等5种氮源被用于固体发酵产纤维素酶，40℃，培养基初始 pH 为 5.5，培养 4 d。设（NH4）2SO4为氮源时酶活为100%，测定不同氮源相对酶活作图，结果见图6。

图6 不同氮源对纤维素酶生产的影响Fig.6 The effect of nitrogen source on activity of cellulase

蛋白胨、黄豆饼粉等有机氮源产酶相对较低，NH4NO3可以明显提高产酶能力，比（NH4）2SO4为氮源提高 16%，达到 2.35×10-7kat/mL。

3 小结

紫外线诱变育种是国内外广泛采用的提高菌种性能的育种方法，具有损伤轻、突变频率高、突变谱宽、突变性状稳定等突出的优点，应用此方法可以选育到很多优良突变株[14]。灰白青霉HML0233经过紫外诱变，经过羧甲基纤维素钠平板快速筛选得到一株PFA酶活达到1.46×10-7kat/mL的纤维素酶高产菌株HBQ14，经过发酵条件初步优化研究，以NH4NO3为氮源，40℃，pH 5.5培养4 d，PFA酶活达到2.35×10-7kat/mL，灰白青霉HBQ14遗传性状稳定。课题计划对灰白青霉HBQ14产纤维素酶发酵条件进一步优化，对纤维素原料进行预处理，进一步提高产酶量和水解纤维素糖化率，为应用于纤维素酶的工业化生产提供实验依据。

[1]Demain A L,Newcomb M,Wu J H.Cellulase,Clostridia,and Ethanol[J].Microbiol Mol Biol Rev,2005,69(1):124-154

[2]王镜岩,朱圣庾,徐长法.生物化学(上册)[M].3版.北京:高等教育出版社,2002:45

[3]何仁春,熊建明,杨家晃,等.粗纤维及纤维素酶对1～2月龄肉兔能量消化率和生长性能的影响 [J].粮食与饲料工业,2011(12):58-61

[4]崔广林,何万领,董淑丽,等.纤维素复合酶对不同生长阶段肉鸡血清生化指标的影响[J].中国饲料,2010(7):22-25

[5]姚穆,孙润军,陈美玉,等.植物纤维素、木质素、半纤维素等的开发和利用[J].精细化工,2009(10):937-941

[6]Lynd L R,Weim P J,Willem Z,et al.Microbial Cellulose Utilization:Fundamentals and Biotechnology[J].Microbiol Mol Biol Rev,2002,66:506-577

[7]Bayer E A,Chanzy H,Lamed R,et al.Cellulose,cellulases and cellulosomes[J].Curr Opin Struct Biol,1998,8(5):548-557

[8]李丹,李晓磊,李荣和.纤维素酶水解大豆异黄酮糖苷混合物的抗氧化活性[J].食品研究与开发,2008(8):1-4

[9]陈渝,李远志.果胶酶和纤维素酶对菠萝汁澄清效果的研究[J].食品研究与开发,2005(6):61-64

[10]何海燕,覃拥灵.纤维素酶产生菌灰白青霉HML0233的分离及系统分类研究[J].中国饲料,2008,373(17):24-26,37

[11]吴根福,杨志坚.发酵工程实验指导实验[M].北京:高等教育出版社,2006:29-32

[12]Mandels M,Andreott R E,Rochei C H.Measurement of saccharifying cellulose[J].Biotechnology&bioengineering symposium,1976(6):21-33

[13]Sugimura M,Watanabe H,Lo N,et al.Purification,characterization,cDNA cloning and nucleotide sequencing of a cellulase from the yellow-spotted longicorn beetle,Psacothea Hilaris[J].Eur J Biochem,2003,270(16):3455-3460

[14]诸葛健,玉正祥.工业微生物实验技术手册[M].北京:中国轻工业出版社，1994:391-392