张海滨，赵良娟，吴冬雪，张海英，张霞，刘培，郑文杰

（天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心，天津 300461）

食品辐照是20世纪发展起来的一种食品保藏技术。利用电离辐射对食品和其他农副产品进行加工处理，以达到控制食源性病原体，减少微生物污染和虫害，抑制发芽和延长易腐农产品使用期的目的[1]。其具有冷加工处理、无二次污染和化学残留、能耗低等优势[2]。截至2005年，全世界辐照食品销售总量已达到40.5万t[3]。自从食品辐照技术出现以来，几十年的动物毒理试验的研究结果一致表明，食用辐照食品的动物生长、发育、遗传与食用不辐照食品的动物完全相同，三致试验（致畸、致癌、致突变）结果也没有明显变化，至今还没有任何相反的报告。1980年，联合国粮农组织（FAO）/世界卫生组织（WHO）/国际原子能机构（IAEA）组成的联合专家委员会宣布，吸收剂量在10 kGy以下的任何辐照食品都是安全的，无需做毒理学试验。1999年，FAO/IAEA/WHO高剂量辐照食品研究小组经过长期的研究工作，在报告中明确提出了超过10 kGy剂量的辐照食品也是卫生安全的。2003年，国际食品法典委员会（CAC）进一步规定允许在不对食品结构的完整性、功能特性和感官品质发生负面作用和不影响消费者的健康安全性的情况下，食品辐照的最大剂量可以高于10 kGy[4]。这些标准的通过在一定程度上减少了消费者对辐照食品安全的担心，促进了辐照技术在食品包装材料、粮食、水果等杀虫、灭菌等领域的发展和应用。

CAC目前发布的辐照食品鉴定方法主要有3大类10个检验方法，主要有化学分析法、生物学分析法和物理分析法[5]。我国目前在食品辐照领域获得了巨大的发展，但我国在辐照食品的质量监控与安全性规范方面还存在一些不足。自1994年起，我国先后颁布食品辐照处理的技术工艺标准及辐照标示管理的标准40余个，从技术工艺和标示上对辐照食品进行了规范，但是对于辐照食品鉴别技术的研究与国际标准的发展尚有差距。截至2011年，我国先后发布了2项国家标准、1项出入境检验检疫行业标准及3项农业标准：GB/T 21926-2008《辐照含脂食品中2-十二烷基环丁酮测定气相色谱/质谱法》、GB/T 23748-2009《辐照食品的鉴定DNA彗星试验法筛选法》、SN/T 2522.1-2010《进出口辐照食品检测方法微生物筛选法》、NY/T 1207-2006《辐照香辛料及脱水蔬菜热释光鉴定方法》、NY/T 1390-2007《辐照新鲜水果、蔬菜热释光鉴定方法》、NY/T 1573-2007《辐照含骨类动物源性食品的鉴定-ESR法》。

生物学分析方法中的直接荧光过滤技术/平板计数（DEFT/APC）方法是一种辐照食品鉴别初筛方法，具有操作简便、硬件要求不高、高通量的优势，同时能够在鉴别检测同时监测食品的微生物卫生状况[6]。本文对该方法用于鉴定辐照香辛料及脱水蔬菜进行了研究。

1 分析方法

1.1 样品

1.1.1 分析样品

为保证样品条件符合方法分析及验证要求，样品必须未经杀菌处理，故采样环节尽量避免这些过程的混入，或经过筛选检测需氧菌计数后选择符合要求的样品。根据我国批准范围和产品特性，搜集了以下样品：辣椒、黑胡椒、鼠尾草、姜、豆蔻、洋葱、山茴香、花椒、姜黄、百里香、罗勒，脱水蘑菇、脱水青椒、脱水尖椒、脱水番茄、脱水胡箩卜，共计16种样品，见表1，样品购自北京及天津地区香辛料批发市场。

表1 辐照样品及性状Table 1 The names and properties of the irritated samples

1.1.2 分析样品的制备

辐照剂量（吸收剂量）：分别为 4、5、10 kGy，同时以未辐照样品作为对照，即0 kGy。辐照源采用60Co，将原始样品充分混匀，每份取50 g样品无菌分装至无菌封口透明树脂袋中，其外再以一透明树脂袋包装，作好标记，每个样品种类按照10份平行试验分装。送至辐照中心按照指定剂量进行辐照处理。

1.2 方法

1.2.1 方法原理

本方法是将由直接落射荧光过滤检测（DEFT）结果与平板计数法（APC）结果进行对比。APC方法检测结果为辐照处理样品中残存活菌数，DEFT结果为样品中活菌数及辐照处理后失活的细菌总数。将一定体积的样液通过滤膜减压过滤。以吖啶橙对截留在滤膜上的微生物进行荧光染色，在450 nm～490 nm蓝光下产生橙色至橙黄色荧光，见图1。

图1 调味料直接落射荧光显微镜下发光特征Fig.1 The fluorescence character of spice samples under an epifluorescent microscope

APC及DEFT结果之间差值与特定阈值比较，判断样品是否经过辐照处理，如差值大于该阈值为阳性，反之则为阴性。

1.2.2 仪器及试验器具

薄膜过滤器，抽滤瓶及抽滤漏斗，纤维素酯滤膜（孔径 0.2 μm，直径 47 mm），聚丙烯滤膜（孔径 10 μm，直径25 mm），白色聚碳酸脂滤膜（孔径0.6 μm，直径25 mm），无菌快速滤纸，落射荧光显微镜，载玻片和盖玻片，其他微生物常规检测设备及器具。

1.2.3 试剂及培养基

8.5 %生理盐水，平板计数琼脂，缓冲溶液（pH 3.0），吖啶橙染色液，2-丙醇，所有试剂使用前须进行无菌过滤，培养基应进行高压灭菌。

1.2.4 检测步骤

1.2.4.1 样品过滤

取5 g试样置于盛有45 mL灭菌蛋白胨盐水稀释液的锥形瓶中，剧烈摇动锥形瓶约30 s。将样液通过无菌快速滤纸过滤。倍比稀释后进行DEFT检测及APC检测。以预热至80℃过滤除菌的1%Triton X-100过滤清洗薄膜过滤器3次，再用沸水清洗过滤塔3次。将0.6 μm聚碳酸酯膜光面朝上放置在薄膜过滤器中然后在其上放置10 μm孔径的聚丙烯滤膜。将2 mL样液经过滤器过滤。在真空泵运行状态下将放置在白色聚碳酸酯膜上的10 μm孔径的聚丙烯滤膜移去。取2 mL无菌生理盐水按照上述操作进行作为空白对照。过滤不同样品前须用沸水过滤清洗滤筒三次。

1.2.4.2 染色和制备DEFT玻片

关闭真空泵，在滤塔内加入2.5 mL吖啶橙溶液，2 min后开启真空泵吸去吖啶橙溶液。保持连接真空泵运行并迅速用2.5 mL pH3.0缓冲液清洗滤膜。最后用2.5 mL 2-丙醇快速过滤清洗滤膜。关闭真空泵，用镊子将聚碳酸酯膜夹起晾干。在载玻片中心滴一滴浸镜油，将滤膜光面朝上放置在油滴中心。在滤膜中心再滴一滴浸镜油。将盖玻片放置于上方，轻轻地向下挤压盖玻片减少油层厚度。

1.2.4.3 平板计数（APC）

过滤和稀释样品后15 min内按照GB4789.2《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》进行APC检测。在无菌培养皿中加入1 mL适当稀释度的样液然后加入大约15 mL平板计数琼脂 [预先冷却至（47±2）℃]混匀。待琼脂凝固后将其倒置于（30±1）℃的培养箱内培养72 h。

1.2.4.4 DEFT计数

将DEFT片放入落射荧光显微镜下观察，对可见的DEFT单位进行计数，在盖玻片上滴一滴浸镜油，置于荧光显微镜下，用100×oil物镜观察，在随机选择的显微视野下，计数发黄色和橙黄色荧光的微生物DEFT计数单位。

1.2.4.5 计算结果

计算DEFT数，见公式（1）和（2）

式中：x为每克样品中DEFT单位数；N为DEFT单位的总和；n为计数的显微视野数；M为显微镜系数；D为样品稀释因子 （例如5 g样品＋45 mL蛋白胨盐水稀释液=10 mL/g）；F为有效过滤面积，mm2，可测量过滤塔底部的直径（r1=半径）计算得出；A为显微视野面积，mm2，可使用镜台测微计（最大量程0.01 mm）测量显微视野的直径（r2=半径）计算得出；V为样品体积，mL；每克香料中的DEFT数及其对数形式保留2位有效数字。

计算APC。依据GB 4789.2《食品安全国家标准食品微生物学检验 菌落总数测定》的计算方法，培养后的培养皿可进行需氧微生物计数（APC计数）。依据样液体积和稀释因子对每克样品中所含的微生物计数，数值可用菌落形成单位（cfu）来表述。APC数保留2位有效数字，转成对数后也保留2位有效数字。

计算DEFT与APC差值。DEFT数和APC数分别取对数，求得差值（Dc）。见公式（3）。

式中：A为取log10换算后的DEFT值；B为取log10换算后的APC值。

2 检测结果

按照步骤1中试验方法，A～P样品共计16种样品基质检测后，计算Dc值结果。以箱线图形式表示，见图2。

所有4组样品即0、4、5、10 kGy辐照剂量下Dc平均值之间差异显著（P<0.001）。0 kGy辐照剂量下Dc平均值最大值3.0，最小值1.3，单次检测数据最大3.1，最小0.5。4 kGy辐照剂量下Dc平均值最大值5.1，最小值3.1，单次检测数据最大5.5，最小2.5。5 kGy辐照剂量下Dc平均值最大值5.7，最小值3.6，单次检测数据最大6.5，最小3.1。10 kGy辐照剂量下Dc平均值最大值7.5，最小值5.6，单次检测数据最大8.4，最小5.2。每种样品均呈现随着辐照剂量升高，Dc值亦增加的趋势。未经辐照即0 kGy样品Dc值为0.5～3.1，阈值低于3.0可能导致假阳性判读增加；当Dc大于等于3.0时，样品至少经过5.0 kGy以上剂量辐照处理。所以，以3.0为判定阈值，可检测出全部5 kGy辐照处理样品，此时的假阳性率为3.1%。当以4.0为判定阈值时，则会有部分假阴性结果。作为初筛方法，假阴性结果会导致漏检，应避免或使其降至最低。因此，对于本研究中的16种样品设定判定阈值为3.0，可对5.0 kGy及5.0 kGy以上剂量处理的样品进行初筛鉴定。

3 讨论

图2 0、4、5、10 kGy 辐照样品检测结果Fig.2 The testing results of samples irradiated under the dose of 0，4，5，10 kGy

鉴定辐照食品的微生物学初筛方法的灵敏度、适用性及可靠性主要受以下因素影响：样品处理过程对计数结果的影响，计数判读的准确性，样品本身抑菌特性，样品初始含菌量及菌群构成。样品中含有的杂质、油滴和破碎细胞均可能对DEFT计数造成不利影响，在样品前处理过程中采用两步过滤法，即滤纸过滤及10 μm孔径聚丙烯滤膜过滤，可有效去除杂质颗粒影响；对于游离疏水基团含量大的基质，可参考ISO6887的方法进行样品前处理。DEFT检测时荧光染色过程中应注意染色及脱色时间的控制；在荧光显微镜目视计数中，荧光照射时间不能过长或过短，一般以1 min为宜。有些样品，如丁香、肉桂、大蒜和芥末具有一定的抑菌特性，在利用微生物学方法检测时应注意出现假阳性。此外，如果样品初始染菌量过低，如低于103cfu/g，会导致低于方法检测限，也不适用本方法检测[7]。各种微生物具有不同的辐照D10值，该值与辐照加工所需吸收剂量及微生物抗辐射力为正相关关系，香辛料及脱水蔬菜中一般分布的有芽孢杆菌、枯草杆菌、脂肪嗜热杆菌、沙门氏菌、大肠菌群、霉菌及酵母菌等[8]，芽孢杆菌相对抗辐射能力较强，因此微生物的群落构成也会导致Dc值区间的变化及阈值的设定。Gun Wirtanen等研究中对于香辛料采用的阈值为3.5，能够初筛鉴别5.0 kGy以上辐照处理样品[6]。K.N.Oh等研究了韩国产胡椒粉等，采用阈值2.5能检测3.0 kGy以上辐照样品[9]。本文主要针对产自国内香辛料及脱水蔬菜样品开展研究，所研究的16种样品在阈值设定为3.0时，可初筛鉴别经5.0 kGy以上辐照样品，且假阳性率较低，为3.1%。

4 结论

直接荧光滤膜/平板计数法初筛鉴定辐照食品的方法可用于我国调味料及脱水蔬菜的辐照鉴定，对于本文研究的11种香辛料及5种脱水蔬菜，设定阈值3.0可检测经5.0 kGy以上辐照样品。该方法除可应用于辐照调味料和脱水蔬菜的鉴定，还可以同时进行辐照产品卫生指标的监控，其具有操作简便、硬件要求不高和实现多样品同时检测的特点，除了本文涉及的样品基质种类，其他如乳制品、水产品、冷冻肉制品等也可应用本方法进行有效鉴别。

[1]张奇志,王文亮,孙宏春,等.我国辐照食品的研究现状及发展前景[J].中国食物与营养,2007(2):29-31

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[5]冯敏,刘春泉,朱佳廷.辐照食品鉴定方法研究进展及展望[J].江苏农业科学,2007(6):271-274

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[8]施培新.食品辐照加工原理与技术[M].北京:中国农业科学技术出版社,2004:363-367

[9]Oh K N,Lee S Y,Lee H J,et al.Screening of gamma irradiated spices in Korea by using a microbiological method(DEFT/APC)[J].Food Control,2003(14):489-494