侯忠杰，齐善厚，张家瑞

（1.衡水市中医院，河北 衡水 053000；2.衡水学院，河北 衡水 053000）

覆盆子（raspberry）又称树莓、大号角公，蔷薇科悬钩子属浆果植物。覆盆子果实富含氨基酸、矿质元素、有机酸和VE人体必需的营养素外，还含有黄酮、多糖、粗三萜等功能性物质[1-2]。

覆盆子黄酮类化合物是覆盆子代谢过程中产生的重要天然有机化合物，是覆盆子中主要活性成分之一，具有抗氧化[3]、抑菌消炎、消除自由基[4-5]抗过敏、抗感染、抗突变等生理活性，且毒性较低，因此可用作食品、化妆品的天然添加剂，黄酮类化合物一直是国外研究开发利用的热点，仍是寻找有开发应用前景的先导化合物[6]。

本研究在前期覆盆子黄酮超声波提取研究的基础上，对覆盆子黄酮一次萃取后，利用HPLC法进行分析，选取不同萃取剂对覆盆子黄酮进行二次萃取的研究，以期选出效果较好的萃取剂，为覆盆子黄酮单体的分离纯化提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

覆盆子干果（一级品购于衡水市中医院药店）粉碎过60目筛，50℃烘干备用。样品成分分析中所用化学试剂均为分析纯或生化试剂。

山奈酚、槲皮素、槲皮苷、香橙素标准品：购于国家标准物质中心，纯度>97%。

氯仿、正丁醇、乙酸乙酯、乙酸丙脂、乙酸丁脂均为分析纯。

1.2 仪器

XA-1固体样品粉碎机：金坛市开发区吉特实验仪器厂；HH-6恒温水浴锅：上海康华生化仪器厂；UV-250分光光度仪：日本岛津；高效液相色谱：Agilent公司；真空旋转蒸发仪：巩义市英峪仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 覆盆子黄酮提取方法

称取粉碎后覆盆子粉末100 g于三角瓶中，加入1L 95%乙醇于50℃下进行提取，提取时36 h，提取过程中分别于第12小时和第24小时时进行超声提取，超声功率300 W，超声时间25 min，50℃提取时，不断振摇。

1.3.2 抽虑、旋蒸

经乙醇提取的混合液进行抽虑进行固液分离，得覆盆子乙醇提取液。经抽滤得到乙醇提取液于60℃下真空旋蒸，回收乙醇，得到覆盆子乙醇提取物。

1.3.3 覆盆子黄酮一次萃取

经旋蒸后得到的覆盆子乙醇提取物为膏状物，加入100 mL去离子水于旋蒸瓶中，超声溶解，将此水溶物转移至500 mL分液漏斗中，石油醚萃取三次，弃去石油醚层，留水层。

1.3.4 覆盆子黄酮二次萃取

一次萃取后所得水层分为五等份，每份分别用氯仿、正丁醇、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯进行二次萃取，分别萃取三次，合并萃取液，真空旋蒸得到黄色粉状物，50 mL 95%乙醇溶解后再次进行旋蒸数次，直至残留物除乙醇味无其他异味为止。

1.3.5 覆盆子乙醇提取物液相色谱分析样品处理及条件

取1 mL经抽虑后的覆盆子黄酮乙醇提取液，用70%乙醇定容至100 mL，用40 μm孔径滤膜过滤后，进行高效液相色谱测定。

色谱条件为色谱柱：C18柱；流动相：甲醇∶0.4%磷酸=7∶3；柱温：40 ℃；流速 0.4 mL/min；柱压：48 Pa；进样量 10 μL。

1.3.6 覆盆子黄酮二次萃取物液相色谱分析样品处理及条件

色谱条件为色谱柱：C18柱；流动相为甲醇∶0.5%磷酸 6∶4；柱温：40 ℃；流速 0.2mL/min；柱压：48 Pa；进样量 10 μL。

1.3.7 标准品处理、色谱条件及液相色谱谱图

准确称取经二次萃取旋蒸得到的黄粉状物1 mg，用70%乙醇溶解并定溶至100 mL，用40 μm孔径滤膜过滤后，进行高效液相色谱测定。色谱条件同上。经HPLC检测后，谱图见图1～图5。

图1 槲皮苷HPLC谱图Fig.1 The HPLC spectrum for the quercitrin

图2 香橙素HPLC谱图Fig.2 The HPLC spectrum for the aromadendrol

图3 槲皮素HPLC谱图Fig.3 The HPLC spectrum for the quercetin

图4 山奈酚HPLC谱图Fig.4 The HPLC spectrum for the kaempferol

图5 4种标准品HPLC谱图Fig.5 The HPLC spectrum for the four standard

2 结果与讨论

2.1 覆盆子黄酮乙醇提取液HPLC分析

覆盆子黄酮经乙醇提取，抽滤、稀释、滤膜过滤后，经HPLC分析，结果如图6所示。

图6 覆盆子黄酮乙醇提取液HPLC谱图Fig.6 The HPLC spectrum for the ethanol extract of the raspberry flavonoids

由图6可知，覆盆子黄酮乙醇提取液根据出峰时间，共有23种物质，大部峰能够分开，说明此液相色谱条件较适合于覆盆子黄酮乙醇提取物的分离分析，峰面积较大、峰行较好的峰分别出现于4.243、5.212、5.362、5.530、6.257、7.597、10.513、11.362、13.163、14.246、15.530、16.108、17.230、19.087、19.583、21.282 min 等位置，和4种标准品谱图相比，覆盆子黄酮乙醇提取液HPLC谱图中都有与其出峰时间相近的峰出现，出峰时间分别为 6.257、15.530、19.087、21.282 min，表明覆盆子黄酮乙醇提取液中含有已知的四种黄酮单体，除此之外可能还存在其它黄酮单体及杂质，有待于进一步除杂分析。

2.2 氯仿二次萃取HPLC分析

覆盆子黄酮乙醇提取液经处理、一次萃取后，用氯仿进行二次萃取，经HPLC分析后，结果如图7所示。

图7 氯仿二次萃取HPLC谱图Fig.7 The HPLC spectrum for the second extraction of chloroform

由图7可知，经氯仿二次萃取后，覆盆子黄酮乙醇提取物HPLC图谱中只有3个峰存在，出峰时间为6.250、7.460、8.458 min，虽然其中一个峰的出峰时间6.250与标准品单体槲皮素相近，但3个峰连在一起，没有分开，可能由于HPLC色谱条件不适宜所致，经氯仿二次萃取后，萃取物单体较少，所以氯仿不适宜作为覆盆子黄酮乙醇提取物的二次萃取剂。

2.3 正丁醇二次萃取HPLC分析

覆盆子黄酮乙醇提取液经处理、一次萃取后，用正丁醇进行二次萃取，经HPLC分析后，结果如图8所示。

图8 正丁醇二次萃取HPLC谱图Fig.8 The HPLC spectrum for the second extraction of n-butanol

由图8可知，经正丁醇萃取后，覆盆子黄酮乙醇提取物HPLC图谱中也只有3个峰存在，出峰时间为6.095、6.470、7.361 min，3 个 峰 虽 能 分 开 ，但 只 有6.470 min的峰峰行较高，峰面积较大，其它两个峰峰行较低，峰面积较小，说明萃取出的两物质含量较少，分析后可知，经正丁醇二次萃取后，，萃取出的单体物质较少，且只有一种物质的含量较高，所以，正丁醇也不适宜作为覆盆子黄酮乙醇提取物的二次萃取剂。

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2.4 乙酸丙脂二次萃取HPLC分析

覆盆子黄酮乙醇提取液经处理、一次萃取后，用乙酸丙脂进行二次萃取，经HPLC分析后，结果如图9所示。

图9 乙酸丙脂二次萃取HPLC谱图Fig.9 The HPLC spectrum for the second extraction of n-propyl acetate

由图9可知，经乙酸丙脂萃取后，覆盆子黄酮乙醇提取物HPLC图谱中峰面积较大、峰行较好的峰有7个，出峰时间分别为 5.363、6.126、15.043、16.054、21.191、21.356、22.105 min，和四种黄酮标准品单体相对照，有3个峰的出峰时间和标准品相似，但7个峰都存在峰与峰不能分开的情形，此种萃取方式萃取出的黄酮混合物不利于下一步的覆盆子黄酮单体的分离纯化，因此此种萃取方式不可取。

2.5 乙酸丁脂二次萃取HPLC分析

覆盆子黄酮乙醇提取液经处理、一次萃取后，用乙酸丁脂进行二次萃取，经HPLC分析后，结果如图10所示。

图10 乙酸丁脂二次萃取HPLC谱图Fig.10 The HPLC spectrum for the second extraction of isobutyl acetate

由图10可知，经乙酸丁脂萃取后，覆盆子黄酮乙醇提取物HPLC图谱中峰面积较大、峰行较好的峰有6个，其中有3个峰的出峰时间和标准品相似，出峰时间分别为：6.193、16.026、21.275 min，所分离出的 6 个峰中，只有2个峰为单独峰，其它4个峰未能完全分开。

2.6 乙酸乙脂二次萃取HPLC分析

覆盆子黄酮乙醇提取液经处理、一次萃取后，用乙酸乙脂进行二次萃取，经HPLC分析后，结果如图11所示。

图11 乙酸乙酯二次萃取HPLC谱图Fig.11 The HPLC spectrum for the second extraction of acetic ether

由图11可知，经乙酸乙酯萃取后，覆盆子黄酮乙醇提取物HPLC图谱中峰面积较大、峰行较好的峰有7个，其中4个峰的出峰时间和标准品相似，出峰时间分别为：6.242、16.027、19.093、21.123 min，和其它萃取不同的是，经过乙酸乙酯萃取后，所分出的7个峰都能较好的分开，峰行较好，萃取的单体成分中含有4种标准品物质的可能性很大。此种萃取效果极有利于下一步覆盆子黄酮单体的分离纯化。

2.7 几种二次萃取结果分析比较

几种萃取结果比较见表1所示。

表1 几种萃取方式分析比较Table 1 The contest of the extraction methods

由表1可知，经5种萃取剂对覆盆子黄酮二次萃取后，液相色谱测定出峰时间，根据出峰个数及出峰时间和标准品对照，乙酸丙脂、乙酸丁酯、乙酸乙酯二次萃取效果明显好于氯仿和正丁醇，3种脂类萃取中，经乙酸乙脂萃取后，出峰个数最多，单物质峰与峰之间分开效果良好，且和标准品出峰时间相当的峰分离效果较好，对比之下，乙酸乙脂萃取效果好于其它。因此覆盆子黄酮乙醇提取物二次萃取选择乙酸乙酯作为萃取剂。

3 结论

覆盆子黄酮乙醇提取液经处理、一次萃取后，用氯仿、正丁醇、脂类进行二次萃取，经HPLC分析可知，脂类的二次萃取效果好于氯仿和正丁醇，脂类萃取中，乙酸乙脂萃取后，出峰个数最多，且单物质峰与峰之间分开效果良好，单物质峰出峰时间有四种和四种标准品相似，相比之下，乙酸乙脂萃取效果好于其它。因此覆盆子黄酮乙醇提取物二次萃取选择乙酸乙酯作为萃取剂。

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