王淑英 李慧玲 李文 侯丽然 张辉 原德新 斗章

缺血-再灌注损伤是在缺血性损伤的基础上发展而来的，涉及许多疾病的发病机制并影响其愈后。再灌注可以使可逆性缺血加重，即可能促进可逆性缺血损伤转化为不可逆性损伤。寻找有效的防治脑缺血再灌注损伤药物已成为国内外的研究热点[1，2]。本实验运用电镜、光化学分析方法研究EGB对大鼠局灶性脑缺血-再灌注损伤的影响，以期在脑缺血-再灌注损伤的预防与治疗中为EGB的开发和临床应用提供足够的实验依据。

1 材料与方法

1.1 一般材料 健康Wistar大鼠75只，体重280～380 g，雌雄不限，随机分为3组。动物由佳木斯大学实验动物中心提供。动物术前12 h禁食，自由饮水。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 随机将大鼠分为假手术组(Sham组):25只，做动脉分离手术，不栓塞大脑中动脉;缺血-再灌注组(I/R组):25只，大脑中动脉栓塞2 h，再灌注24 h;EGB干预组(EGB+I/R):25只，对其进行大脑中动脉栓塞2 h，栓塞后2 min内尾静脉注射 EGB(20 mg/kg)，再灌注24 h，其间给3次药。

1.2.2 实验动物模型的制备及干预 参照Nagasawa、汪家龙、马常升等[3-5]报道的方法，采用颈内动脉插入线栓法造模。Wistar大鼠用3.5%水合氯醛(350 mg/kg，腹腔注射)麻醉，仰卧固定。切开颈部正中皮肤，钝性游离右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)，仔细分离以免刺激迷走神经。由CCA分叉处向头端依次游离，并用电热烧灼器烧断颈外动脉所有分枝，使其主干游离备用。然后分离ICA至颅底，并分离出 ICA颅外段的惟一分支翼腭动脉(PPA)。用蛙心夹夹住CCA和ICA，并在ECA(靠近CCA分叉处)上剪一小口，将一端涂有聚氨酯的栓子(预先蘸有肝素钠溶液)沿切口插入ECA，经CCA分叉处并将预先放置于ECA根部的手术缝合线扎紧，以防止其中的栓子滑出和出血，然后放开ICA上的蛙心夹，将栓子缓慢地向ICA入颅方向推进约19～21 mm，微遇阻力即停，使栓子头端停留在大脑中动脉(MCA)与大脑前动脉(ACA)分叉处。固定栓子，即完成一侧MCA的栓塞。栓塞2 h后，缓慢的轻拉栓子使其头端回到ECA内，可实现MCA再灌注。假手术组除不插线外，全过程同模型组。术后2 min尾静脉给药，20 mg/kg，3次/d，假手术组和模型组给予等体积生理盐水。各组大鼠均在再灌注24 h后取材。

1.2.3 神经病学评分 参考Kuluz[6]神经缺陷三级评分标准，动物清醒后分别在对应时点进行评分。标准如下:0级:无缺陷，活动正常;Ⅰ级:右侧Horner's征阳性;Ⅱ级:提尾悬空时左前肢曲屈、内收;Ⅲ级:自主运动时向偏瘫侧(左侧)划圈。脑缺血后，上述Ⅰ～Ⅲ级三项体征均出现的大鼠，才视为造模成功，进入下一步试验。

2.4 电镜标本观察 再灌注24 h后，将动物断头，迅速取右脑，将其修成1 mm×1 mm×1 mm小块，用2.5%戊二醛的0.1 mol/L磷酸缓冲液固定，丙酮梯度脱水、环氧树脂浸透包埋，超薄切片，厚50 nm，醋酸铀染色观察线粒体及核膜变化。

2.5 SOD和MDA的测定 2.5.1 样本处理 大鼠脑缺血-再灌注至24 h后，迅速断头取右脑，在冰盘中以脑组织(mg):生理盐水(ml)=10∶1的比例，在盛有冰块的器皿中用玻璃匀浆器碾磨成脑匀浆，4℃3000 r/min离心机离心20 min，取上清液于～30℃以下保存待测。

2.5.2 SOD测定 采用黄嘌呤氧化酶发光法。

2.5.3 MDA的测定 用硫代巴比妥酸法(TAB)测定。

2.6 数据分析和统计处理 所有数据均经计算机运用SPSS软件处理，组间采用方差分析，组内采用独立样本检验。所有结果以均值标准差表示，差异有统计学意义(P＜0.05)。

3 结果

3.1 线粒体电镜观察 假手术组神经元胞质内线粒体较多，呈圆形或椭圆形，内嵴排列整齐、清晰，粗面内质网散在分布，表面有密集的核糖体附着，核膜结构完整(图1);缺血2 h再灌注24 h，电镜下神经细胞内细胞器明显减少，胞浆内线粒体肿大，嵴变短或减少、消失，内质网也扩张，其上的核糖体脱失，胞浆中糖原减少，自噬泡增多，核膜不完整或缺失(图2);EGB干预组核膜结构与正常组无明显差别，线粒体稍有轻度肿胀，与缺血-再灌注组比较明显减轻(图3)。

图1 假手术组线粒体电镜像20 k

图2 模型组线粒体电镜像20 k

图3

3.2 SOD和MDA水平的变化(见表1)。

表1 大鼠SOD和MDA水平的变化(±s)

表1 大鼠SOD和MDA水平的变化(±s)

注:给药组与假手术组相比，P＜0.05;与模型组相比，P＜0.05

SOD(U/mgprot)MDA(nmol/mgprot)假手术组150.75±8.95 1.20±0.21 191.17±19.15 1.12±0.06模型组 87.48±16.67 2.02±0.87给药组

4 讨论

线粒体是细胞氧化磷酸化反应的主要部位，再灌注时，线粒体氧化磷酸化功能障碍，损伤的电子传递链成为氧自由基的重要来源。缺血、缺氧使ATP含量减少，Ca2+进入线粒体增多，使线粒体功能受损，细胞色素氧化酶系统功能失调，以致进入细胞内的氧经单电子还原而形成的氧自由基增多，而经4价还原生成的水减少。有学者[7]认为Ca2+进入线粒体可使锰-超氧化物歧化酶减少，对自由基的清除能力降低，进而使自由基含量增加。氧自由基主要包括超氧自由基(O-2·)、过氧化氢(H2O2)、羟自由基(HO·)和单线态氧等。O-2·等活性氧的主要毒性作用是直接损伤细胞膜，使多不饱和脂肪酸过氧化，也使具有膜结构的内质网、溶酶体、线粒体等结构破坏，导致一系列功能紊乱，从而诱导某些疾病的发生[8]。

脂质过氧化作用形成的脂氢过氧化物，在过氧化条件下易分解生成MDA以及新的自由基等。MDA能带着原自由基的损伤潜能[9]，从它生成的部位扩散到其他细胞成份，甚至能从细胞逸出，带着自由基的损伤潜入到其他细胞，引起细胞损伤[10]。

生物体为了防止这些毒性效应，形成了一个完整的抗氧化防御系统。机体中的抗氧化酶主要有SOD和各种过氧化物酶。SOD可催化O-2·生成H2O2和O2，减少O-2·对组织的损伤。SOD被认为是人体内消除 O-2·毒性效应的最重要保护酶，其可减少O-2·对细胞内含巯基的蛋白质的损伤，防止酶失活。SOD可干扰吞噬细胞生成的O-2·有利于损伤的修复。

本研究发现，大鼠脑缺血再灌注后，其脑组织内SOD活性明显下降，而MDA含量却明显升高，线粒体损伤较严重。可能是脑缺血再灌注后，脑内缺氧、脂质过氧化作用加强所致。提示，脑缺血再灌注后可使脑抗氧化能力降低。另外，本研究发现，EGB治疗组脑组织内SOD活性较模型组明显增加，而MDA的含量明显下降，线粒体损伤较轻。这可能是由于EGB通过改善细胞氧化磷酸化反应，使SOD活性增强，对自由基的清除能力增强，进而使自由基含量降低，从而对缺血-再灌损伤的脑组织起到保护作用。

[1]陈芬芳，汤永红.Bcl-2与脑缺血-再灌注损伤关系的研究进展.医学信息(上旬刊)，2011，24(2):821-822.

[2]黄昕艳，张道春，陈丽.纳洛酮对大鼠局灶性脑缺血-再灌注损伤后的脑保护作用.心血管康复医学杂志，2008，17(2):162-164.

[3]Nagasawa H，Kogure K.Correlation between cerebral blood flow and histologic changes in a new rat model of middle cerebral artery occlusion.Stroke，1989，20:1037-1043.

[4]汪家龙，刘才栋.实验性急性脑缺血模型及其研究进展.解剖科学进展，1999，15(3):212-214.

[5]马常升，马文领.插线法制备大鼠局灶性脑缺血-再灌注模型的研究.解剖学杂志，1999，22(3):209-213.

[6]Kuluz JW，Prado RJ，Dietrich D，et al.The effect of nitric oxide synthase inhibition on infarct volume after reversible focal ischemia in conscious rats.Stroke，1993，24:2023.

[7]陈晔，王文宇，王致喻，等.局部缺血猫脑的透射电镜观察.中国神经精神疾病杂志，1991，17:139.

[8]Bulkley G B.Free radical-mediated reperfusion injury:a selective r eview.Br J Cancer，1987，55:66-78.

[9]Esterbauer H.Aldehydic products of lipid peroxidation.In Free Rad icals，Lipid Peroxidation and Cancer.London:Acadenlic Press，1982:101-128.

[10]Halliwell B and Gufferidge J M C.Free radicals in biology and medicine.Oxford Clarendon Press，1989:196-226.