田建军，张开屏，张保军，靳 烨，*

（1.内蒙古农业大学食品科学与工程学院，内蒙古呼和浩特010018；2.内蒙古商贸职业学院工程系，内蒙古呼和浩特010018）

一株高效降胆固醇嗜酸乳杆菌在发酵乳中的应用

田建军1，张开屏2，张保军1，靳 烨1，*

（1.内蒙古农业大学食品科学与工程学院，内蒙古呼和浩特010018；2.内蒙古商贸职业学院工程系，内蒙古呼和浩特010018）

采用高效降胆固醇嗜酸乳杆菌菌株2-2和嗜热链球菌调制发酵剂B，研究了发酵剂B在发酵乳中的应用。通过与传统保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌调制的发酵剂A的对比，结果表明，发酵剂B有较强的胆固醇去除效力和弱的后酸化能力。4℃条件下存放15d后发酵乳的酸度为103.6°T，发酵乳中乳酸菌活菌数为2.6×107cfu/mL，高于标准的最低限制（≥106cfu/mL）。研究表明，在降胆固醇和抑制后酸化意义上，发酵剂B能够取代发酵剂A。

嗜酸乳杆菌，降胆固醇，发酵乳，应用

众所周知，血清中胆固醇的含量被认为是诱发心脑血管疾病的主要因素，统计表明，心脑血管疾病是目前引起人们死亡的主要杀手，而且逐年呈上升趋势[1-2]。同时，人体总胆固醇浓度与膳食脂质摄入之间有着密切的关系，因此降低食品中胆固醇水平关系到人类的健康。国外大量研究发现，乳酸菌具有降低发酵食品和人体血清胆固醇的作用[3-5]。我国传统食品资源丰富，尤其在内蒙古少数民族地区，以酸奶为代表的发酵乳制品含有丰富的乳酸菌群，长期的饮食习惯证实了这些菌群的安全性和可靠性。在欧洲和日本市场上已经有了类似的具有辅助降低血清胆固醇的乳酸菌制品以及低胆固醇含量的食品，但是国内在这方面的研究相对较少。因此，目前研究高效降胆固醇的乳酸菌菌种用于食品加工具有重要的意义。本实验研究了一株高效降胆固醇嗜酸乳杆菌的发酵特性及其对发酵乳中胆固醇的脱出量、发酵乳制品的后酸化和4℃冷藏期间菌株的存活能力，为开发低胆固醇乳制品奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

高效降胆固醇嗜酸乳杆菌1株 内蒙古农业大学乳品生物技术教育部重点实验室筛选获得；保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌 内蒙古农业大学益得乳制品实验厂提供；培养基 MRS培养基[6]；胆固醇、邻苯二甲醛 Sigma公司，均为分析纯；巯基乙酸钠、正己烷、冰醋酸 均为分析纯。

MC-30L型高压蒸汽灭菌锅 日本ALP；SPX-150培养箱 中仪国科（北京）科技有限公司；U-8500分光光度计 上海天美公司；PB-20型pH计 北京多斯利仪器系统有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 胆固醇测定方法的建立 采用OPA法[7]（邻苯二甲醛法）。邻苯二甲醛溶液现用现配，避光保存。

1.2.1.1 胆固醇标准液的配制 参照文献[8]配制。

1.2.1.2 胆固醇标准曲线的绘制 参照文献[8]，以OD550值为横坐标，胆固醇浓度为纵坐标，绘制标准曲线，如图1所示。

图1 胆固醇浓度与OD值的关系Fig.1 The standard curve of cholesterol concentration

1.2.1.3 样品处理及测定[7，9]待测样品0.5g→加无水乙醇3.0mL和50%KOH 2.0mL振荡器混合均匀，60℃水浴保温10min→冷却后加入正己烷5.0mL，混合均匀→加双蒸水3.0mL后再充分混合，室温下静置15min使溶液分层→取正己烷层溶液2.0mL抽干→加入邻苯二甲醛溶液2.0mL，室温保持10min→加入1.0mL浓硫酸，混合均匀，放置10min后→测定OD550值→根据标准曲线回归方程计算出样品中胆固醇的含量。以发酵0h的样品为对照样计算其降解率。

胆固醇降解率（%）=胆固醇降解量/最初胆固醇含量×100%

1.2.2 菌株的活化 使用前将菌株在脱脂乳培养基中活化3代，使菌种活力达到最强。

1.2.3 最适生长温度的测定[10-11，13]菌株于MRS液体培养液中，在不同的温度下培养10h，测定菌液在620nm的浊度。

1.2.4 生长曲线的测定 滴定酸度（°T）采用吉尔涅尔度表示，pH采用pH计直接测量，生长速度采用浊度法表示，菌落计数采用稀释平板计数法。

1.2.5 发酵剂的制备 发酵剂A所用菌种：嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌（1∶1）。发酵剂A制备方法：活化好的发酵剂A所用菌株分别按1%的添加量添加到灭菌（121℃、7min）后急冷的脱脂乳培养基中，37℃恒温培养，培养时间以凝乳后继续培养2h为准，然后在4℃条件下保存备用。

发酵剂B所用菌种：嗜热链球菌与嗜酸乳杆菌菌株2-2（1∶1）。发酵剂B制备方法：与发酵剂A制备方法相同。

1.2.6 发酵奶的制备

1.2.6.1 发酵奶的基本配方 发酵奶1的基本配方：牛奶92%、白砂糖6%、发酵剂2%。发酵奶2的基本配方：牛奶87%、白砂糖6%、发酵剂2%、奶油5%。

1.2.6.2 发酵奶制备工艺流程 牛奶检验→离心净乳→配料→预热均质（65℃，20MPa）→杀菌（95℃，10min）→快速冷却到42℃→添加发酵剂→发酵（42℃）→冷却→成品

1.2.6.3 发酵奶制备操作要点 按1.2.6.1中发酵奶的基本配方分别配制发酵奶1和2各1000mL，分别预热后（65℃）在20MPa的条件下均质，分装、杀菌（95℃，10min）、迅速冷却降温至42℃，按2%的添加量添加发酵剂，并在42℃条件下恒温发酵，发酵到滴定酸度（吉尔涅尔度）65°T时降温冷却，由于发酵奶的基本配方和所加发酵剂不同，因此分别记为1-A、1-B、2-A、2-B。其中1和2代表发酵奶的基本配方，A和B代表所加的发酵剂，即A为添加发酵剂A，B为添加发酵剂B。

2 结果与分析

2.1 菌株2-2最适生长温度

1%（V/V）接种菌株2-2的MRS培养液在不同的温度下（20、30、35、40、45℃）培养10h后，于波长620nm下测定培养液的浊度，结果如图2所示。

图2 菌株2-2在不同温度下的生长曲线Fig.2 Growth curve of strain 2-2 in different temperature

从图2可以看出，菌株2-2在不同温度下（20、30、35、40、45℃）生长时，35℃条件下生长最为旺盛，同时在40℃生长10h的OD值大于30℃条件下生长10h的OD值，说明菌株2-2的最适生长点在35℃和40℃之间，这与乳酸菌通常的培养温度37℃相符。

2.2 菌株2-2生长曲线

图3 菌株2-2在MRS中的生长曲线Fig.3 Growth curve of strain 2-2 in medium of MRS

按1%（v/v）接种量接种菌株2-2于MRS培养基中，37℃恒温培养24h，每隔2h测定MRS培养液的pH、波长620nm的吸光值和滴定酸度，用测量的数值和对应的时间作图，就得到菌株2-2在MRS培养液中的生长曲线，如图3所示。

从图3可以看出，在MRS液体培养基中，吸光值的变化范围是0.08～2.22，pH的变化范围是6.5～3.7，滴定酸度的变化范围是18～131°T。菌株2-2在2h后进入对数生长期，10h左右进入稳定期。进入稳定期前，随着时间的增加，pH不断降低。进入稳定期后，pH基本保持不变，滴定酸度继续升高，说明菌株2-2进入稳定期以后仍在生长，只是生长和死亡构成动态平衡。

2.3 菌株2-2对发酵乳中胆固醇脱除量的研究

分别采用发酵剂A和发酵剂B制作酸奶，发酵到达终点酸度时，菌株对发酵奶中胆固醇的降解量以及脱除率如表1所示。

由表1可以看出，对于酸奶1和2来说，发酵剂在发酵过程中对基质中胆固醇都有脱除作用，在发酵奶1中发酵剂A的降解量为10.0μg/mL，降解率为5.39%，发酵剂B的降解量为26.55μg/mL，降解率为14.30%；在发酵奶2中发酵剂A的降解量为33.0μg/mL，降解率为7.83%，发酵剂B的降解量为64.7μg/mL，降解率为15.36%。由此可见，在发酵奶1和2中发酵剂B对基质中胆固醇的脱除率大于发酵剂A对基质中胆固醇的脱除率，其差异显著（P＜0.05）。由此可见，开发新的菌种发酵剂对降低发酵奶自身胆固醇含量具有很大潜力。同时在高脂酸奶中，发酵剂对胆固醇的脱除率均高于普通酸奶，但均小于菌株在培养基MRS-CHOL中培养时对胆固醇的脱除率[8]，可能是由于以下原因造成：其一，在酸奶制作过程中发酵剂的发酵时间较短（一般为4～6h）；其二，酸奶中的胆固醇来源于牛奶或牛奶和奶油，牛奶和奶油中胆固醇的存在形式与MRS-CHOL培养基中添加的胆固醇的存在形式不同，所以菌株对胆固醇的脱除存在差别。

2.4 发酵剂在发酵乳中不同时期的产酸量

采用不同发酵剂发酵的牛乳，在42℃培养过程中定时监测其pH及滴定酸度（吉尔涅尔度°T）的变化。在发酵过程中，在乳酸菌的作用下，分解乳糖产生乳酸，使牛乳的pH下降，滴定酸度上升。测定结果如表2所示，变化趋势如图4所示。

图4表明，发酵剂在乳中的产酸量稳定上升。在发酵初期各供试菌株由于生长缓慢，故产酸能力较弱，宏观表现为pH的降低和滴定酸度的升高较慢。在培养2h后酸度和pH开始发生明显变化，到发酵3h后，相互之间的酸度有了明显差异，1-A发酵乳酸度为57.3而1-B发酵乳的酸度为42.7。1-A发酵到3h后出现凝乳现象，1-B发酵4.5h后出现凝乳现象，1-A发酵4h达到终点酸度，1-B发酵5.5h达到终点酸度。可见在整个发酵过程中，发酵剂A的生长产酸能力强于发酵剂B，发酵剂B要使酸奶达到同样的终点酸度较发酵剂A延迟1.5h。酸奶通常的发酵时间为4～6h，如果从发酵时间上来判断，发酵剂B可以作为酸奶的生产用发酵剂。

图4 42℃发酵乳吉尔涅尔度和pH的变化曲线Fig.4 Changes in titration acidity and pH in milk fermented at 42℃

2.5 在4℃冷藏发酵乳中菌株的存活能力

发酵乳在42℃发酵结束后，转至4℃条件下冷藏保存，在0d和15d分别取乳样。以稀释平板计数法（MRS）测定在15d贮藏过程中供试菌株在冷藏发酵乳中的存活情况，如表3所示。

存活率（%）=[logN/logN0]×100%，其中：N―15d后的活菌数；N0―初始时的活菌数。

由表3中可以看出，在保存初期，发酵奶中活菌数均大于108cfu/mL，在存放两周后活菌数仍然可以达到107cfu/mL以上，存活率分别为80.63%和83.55%。

在发酵剂B中用嗜酸乳杆菌2-2代替了传统酸奶发酵剂A中的保加利亚乳杆菌，嗜热链球菌不变，而嗜酸乳杆菌是微生态制剂中常用的菌种之一，为了确保它们能够充分发挥其健康促进作用，保证制品中嗜酸乳杆菌较高的活菌数是非常关键的。有研究者指出，益生菌制品一个重要的技术特征是“该制品达到消费者的胃肠系统时至少能维持106cfu/mL以上的活菌数，才能发挥潜在的益生效果。”因此，研究嗜酸乳杆菌的存活能力对于开发其相关制品具有重要的实践意义。该实验结果表明，4℃条件下，发酵剂所用菌株在乳中保存15d后，发酵奶能维持107cfu/mL的活菌数，它与常用酸奶发酵剂一样表现出良好的存活能力。这意味着15d的货架期内，嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌发酵乳仍能满足其发挥益生作用的条件。

表1 胆固醇降解实验Table 1 Cholesterol removal rate of starter culture from yoghourt

表2 42℃发酵时的产酸量（n=2）Table 2 Changes in acid production of starter culture in milk feremented at 42℃（n=2）

表3 菌株在4℃冷藏发酵乳中的存活能力（n=2）Table 3 Viability of strains grown in fermented milk and stored at 4℃（n=2）

2.6 在4℃冷藏发酵乳中菌株的产酸能力

除了维持较高的活菌数，评价冷藏期间酸奶的另一指标是看其是否拥有一定的细胞活力以及酸奶的后酸化程度。因此，本研究定期监测了发酵乳在冷藏期间的产酸活力，来反映它们的细胞活力。结果如表4和图5所示。

表4 发酵乳在4℃冷藏期间酸度变化（n＝3）Table 4 Changes in acid production of in fermented milk and stored at 4℃（n＝3）

图5给出了发酵乳在冷藏期间pH和酸度变化的情况。随着保存时间的延长，发酵乳的滴定酸度缓慢上升，1-A的滴定酸度从起始时的66.5°T上升到15d时的136.5°T，pH稳定下降，pH从起始时的4.21下降到15d时的3.72。1-B的滴定酸度从68°T上升到103.6°T，pH从4.23下降到4.05。实验结果表明，发酵剂中的活体细胞仍然维持一定的酸化活力，其中1-B的后酸化现象明显低于1-A，说明如果采用发酵剂B来制作酸奶，其产品在冷藏过程中后酸化可以得到一定的改善。

图5 发酵乳在4℃冷藏期间滴定酸度和pH的变化Fig.5 Changes in titration acidity and pH in fermented milk and stored at 4℃

3 结论

发酵剂B对基质中胆固醇的脱除率大于发酵剂A对基质中胆固醇的脱除率，其差异显著（P＜0.05）。与发酵剂A相比，发酵剂B后酸化程度低。由发酵剂B调制的发酵乳在4℃条件下存放15d后酸度为103.6°T，乳酸菌活菌数为2.6×107cfu/mL，高于标准的最低限制（≥106cfu/mL）。在降胆固醇和抑制后酸化意义上，发酵剂B能够取代发酵剂A用于低胆固醇发酵奶的生产加工中。

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Application of a high cholesterol-reducing Lactobacillus acidophilus strain in fermented milk

TIAN Jian-jun1，ZHANG Kai-ping2，ZHANG Bao-jun1，JIN-Ye1，*
（1.College of Food Science and Engineering，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot 010018，China；2.Engineering Department，Inner Mongolia Business Vocational College，Hohhot 010018，China）

The starter culture B was formulated with strain 2-2 of high cholesterol-reducing Lactobacillus acidophilus and Streptococcus thermophilus.Then the application of starter culture B in fermented milk production was studied.By comparison of starter culture B with A that formulaed traditionally with Lactobacillus bulgaricus and Streptococcus thermophilus，the results indicated that the starter culture B had abilities of strong cholesterol-reducing and weak post-acidification.After 15d storage at 4℃，the acidity of the fermented milk was 103.6°T and the number of living bacteria was 2.6×107cfu/mL，it was much larger than the minimum standard（≥106cfu/mL）.The study indicated that the starter culture A could be replaced by B in a sense of reducing cholesterol and inhibiting the extent of post-acidification.

Lactobacillus acidophilus；cholesterol-reducing；fermented milk；application

TS252.1

A

1002-0306（2012）05-0163-04

2011－05－18 *通讯联系人

田建军（1975-），男，硕士，讲师，主要从事乳制品开发研究。

国家“十一五”科技支撑项目（2006BAD04A06）；2012内蒙古自治区高等学校科学研究项目。