莫学靓 雷建军 唐志晗 王佐

BRAF表达量与神经胶质细胞瘤恶性程度的相关性研究

莫学靓 雷建军 唐志晗 王佐

神经胶质细胞瘤是最常见的原发性颅内肿瘤，其发病机制并不十分清楚。各种原癌基因与抑癌基因的突变或表达量的改变。BRAF基因，与神经胶质细胞瘤的发生密切相关。但BRAF表达量是否与神经胶质细胞瘤的恶性程度相关，未见相关报道，本研究在48例恶性程度不同的神经胶质细胞瘤中，通过免疫组织化学检测了BRAF基因的表达量改变。结果显示BRAF基因在恶性程度高的神经胶质细胞瘤中表达量较高，这提示我们BRAF基因的表达量可能可作为肿瘤恶性程度和预后的一个判断指标，也为干预BRAF基因表达，抑制神经胶质细胞瘤恶变提供了实验基础。

神经胶质细胞瘤;BRAF;RAS

神经胶质细胞瘤是最常见的原发性颅内肿瘤［1］，其发病发生原因复杂，可能与原癌基因的突变，拷贝数改变等遗传因素相关。已有研究证实，EGFR，PDGFRA，PDGF，PDGFR，CDK4，IDH1，IDH2，TP53，CDKN2A，PTEN等基因的突变，缺失或表达量的改变与神经胶质细胞瘤密切相关［2-6］。BRAF，又名鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1，是RAF基因家族成员，属于丝氨酸/苏氨酸蛋白质激酶类，其活化后可激活MEK(ERK激酶)，向MAPK信号通路下游传递细胞有丝分裂信号，导致肿瘤形成。BRAF基因的改变在许多肿瘤中和神经胶质细胞瘤已经报道，但与肿瘤恶性沉淀的的关系报道并不多见，本研究在48例恶性程度不同的胶质细胞中检测

BRAF的表达变化，探讨BRAF表达与神经胶质细胞瘤恶性程度的相关性。

1 材料与方法

1.1 临床样本 选取2007年1月至2011年1月间在永州市人民医院(现更名为永州市中心医院)行手术切除的48例神经胶质细胞瘤作为研究组，所有病例未进行术前化疗。所有病例的诊断依据患者的临床资料和术后病理的确认。肿瘤切除后用于石蜡包埋进行病理诊断和免疫组织化学检测。

1.2 临床资料收集 根据患者的病例资料和病理诊断，详细记录以下临床资料:姓名，性别，年龄，肿瘤大小，肿瘤临床分期，淋巴转移，肿瘤分期采用世界卫生组织AJCC分期系统。

1.3 免疫组织化学 采用免疫组织化学方法，神经胶质细胞瘤中BRAF的表达状况。具体方法如下:常规应用二甲苯脱蜡，梯度酒精脱蜡。蒸馏水新鲜配制3%H2O2室温下灭活内源性过氧化物酶10 min，蒸馏水洗2 min×3次，微波修复抗原:将切片浸入0.01 m枸橼酸盐缓冲溶液(PH6.0)，微波炉中高火加热5 min，冷却10 min，自然冷却，0.1 m PBS洗5 min ×3次，滴加非免疫血清封闭液，室温下封闭30 min，甩去多余的液体，滴加抗兔源性BRAF抗体(Abcam公司)，4℃湿盒过夜，阴性对照滴加兔IgG，0.1 m PBS洗5 min×3次，分别滴加生物素化抗兔IgG二抗(sigma公司)，37℃放置20 min，0.1 mPBS洗3 min min×3次，辣根酶标记链霉卵白素(PBS稀释)，37℃孵育20 min，0.1 m PBS洗3 min×3次，滴加新鲜配制DAB显色剂，镜下控制染色，充分水冲洗终止反应，苏木素轻度复染，脱水，透明，中性树脂封片。在保持显微镜下相同光强度，每张切片拍摄5个视野的照片。免疫组化染色图像使用Image J软件进行分析，进行光密度测定分析，测定平均光密度值。

1.4 统计学方法 利用SPSS 14.0统计软件进行分析。均数间的比较采用方差分析、独立样本t检验，数据以均数±标准差(±s)表示。P＜0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 一般临床资料 本研究中共有神经胶质细胞瘤患者48例，其中男性37例，女11例，年龄范围24岁～71岁(平均54.4±17.2岁)，所有病例均为住院患者并经术后病理确诊。根据世界卫生组织分级标准:Ⅰ期3例，Ⅱ期15例(I+Ⅱ期为高分化神经胶质细胞瘤)，Ⅲ期7例，IV期23例(III+IV期为低分化神经胶质细胞瘤)，一般临床资料见表1。

表1 神经胶质细胞瘤的一般临床资料

2.2 BRAF基因在低分化的神经胶质细胞瘤中呈现高表达在所有48例神经胶质细胞瘤细胞中，我们使用免疫组织化学的方法检测了BRAF基因的表达量，结果显示，BRAF在神经胶质细胞中都呈现胞浆分布，同时，低分化胶质细胞瘤中的信号明显强于高分化的神经胶质细胞瘤(图1)。经过统计学分析，两者具有统计学意义(图2)。

3 讨论

BRAF，又名鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1，是RAF基因家族成员，位于人染色体7q34，包含18个外显子，编码分子量为94kD的蛋白质，由783个氨基酸残基组成，属于丝氨酸/苏氨酸蛋白质激酶家族，在MAPK信号通路中发挥重要作用［7］。BRAF是RET和RAS的下游蛋白激酶，RET可以与细胞膜上的特异受体结合，激活鸟苷酸结合蛋白RAS的GDP解离而结合GTP，从而活化RAS［8］;活化的RAS进一步与丝/苏氨酸蛋白激酶BRAF结合，从而激活BRAF，进而磷酸化MAPK激酶，产生联级反应，最终活化ERKs，转位进入细胞核。ERKs可以激活核内的转录因子如c-fos、c-Jun、Elk-1、cmyc等，从而调节参与细胞增殖与分化的相关基因，在肿瘤发生中产生重要调控作用［9］。

RAS基因突变以及RAS/RAF信号通路的激活在神经胶质细胞瘤中其中重要的作用［10］，本研究在48例神经胶质细胞瘤样本中，探讨了胶质细胞瘤恶性程度与BRAF表达量的相关性。我们的结果提示，恶性程度越高的神经胶质细胞瘤BRAF表达量越高。BRAF的激活有可能激活下游MAPK信号通路，从而引起细胞增殖与分化相关基因表达失调，导致神经胶质细胞瘤的发生。该结果也进一步提示，RAS/BRAF信号通路可能可以作为神经胶质细胞瘤预后的判断指标［11］。同时，针对BRAF基因作为靶点的治疗手段是否能抑制神经胶质细胞瘤的恶性程度还有待进一步研究。

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421001衡阳，南华大学心血管疾病研究所(莫学靓雷建军 唐志晗 王佐);永州市中心医院(莫学靓)

图1 神经胶质细胞瘤标本中BRAF免疫染色(400X)

A:高分化神经胶质细胞瘤，B:低分化神经胶质细胞瘤

图2 神经胶质细胞瘤组织标本BRAF免疫染色统计结果图

*:与高分化神经胶质细胞瘤比较P＜0.05